Departamentul de Nutriție, Școala de Medicină, Universitatea din California, Davis, California

efectele

Departamentul de Nutriție, Școala de Medicină, Universitatea din California, Davis, California

Departamentele de Pediatrie, Facultatea de Medicină, Universitatea din California, Davis, California

Medical Research Institute, Inc., San Bruno, California

Departamentul de Nutriție, Școala de Medicină, Universitatea din California, Davis, California

Departamentul de Nutriție, Universitatea din California, Davis, One Shields Avenue, Davis, CA 95616. E-mail: [email protected] Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamentul de Nutriție, Școala de Medicină, Universitatea din California, Davis, California

Departamentul de Nutriție, Școala de Medicină, Universitatea din California, Davis, California

Departamentele de Pediatrie, Facultatea de Medicină, Universitatea din California, Davis, California

Medical Research Institute, Inc., San Bruno, California

Departamentul de Nutriție, Școala de Medicină, Universitatea din California, Davis, California

Departamentul de Nutriție, Universitatea din California, Davis, One Shields Avenue, Davis, CA 95616. E-mail: [email protected] Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Abstract

Obiectiv: Am raportat că utilizarea glucozei reglează expresia și secreția leptinei din adipocite izolate de șobolan. În acest studiu, am utilizat doi agenți antidiabetici care acționează pentru a crește absorbția glucozei de către țesuturile periferice, metformina și vanadiul, ca instrumente farmacologice pentru a examina efectele modificării utilizării glucozei asupra secreției de leptină în culturile primare de adipocite de șobolan.

Metode și proceduri de cercetare: Adipocitele izolate (100 μL de celule ambalate pe godeu) au fost ancorate într-o matrice definită a componentelor membranei bazale (Matrigel) cu medii conținând 5,5 mM glucoză și incubate timp de 96 de ore cu metformină sau vanadiu. Au fost evaluate secreția de leptină, utilizarea glucozei și producția de lactat.

Rezultate: Metformina (0,5 și 1,0 mM) a crescut absorbția glucozei în prezența insulinei 0,16 nM cu 37 ± 10% (p

Introducere

Studiile in vitro au arătat că insulina crește expresia și secreția leptinei la rozătoarele izolate ((21), (22), (23)) și adipocite umane (15), (24)). Cu toate acestea, nu a fost clar dacă efectul insulinei de a crește producția de leptină este o consecință directă a creșterii semnalizării insulinei sau poate fi indirect mediată de acțiunile insulinei asupra metabolismului glucozei. Mai multe studii in vivo au oferit suport pentru această din urmă explicație. În primul rând, administrarea de glucoză induce creșteri de ob expresia ARNm, care sunt mai strâns legate de modificările glucozei plasmatice decât de concentrațiile plasmatice de insulină (25), (26)).

Metformina și vanadiul sunt doi agenți antidiabetici, care sunt capabili să sporească absorbția și utilizarea glucozei de către țesuturile periferice (29 (29)). În studiul de față, am folosit metformină și vanadiu ca instrumente farmacologice pentru a examina efectele modificării utilizării glucozei adipocite asupra producției de leptină în culturile primare de adipocite izolate. Utilizarea glucozei, producția de lactat și secreția de leptină au fost măsurate timp de 96 de ore în adipocite de șobolan izolate cultivate într-o matrice de membrană bazală care menține diferențierea adipocitelor.

Metode și proceduri de cercetare

Materiale

Mediile (mediul Eagle modificat [DMEM] al lui Dulbecco) și serul bovin fetal (FBS) au fost achiziționate de la Life Technologies (Grand Island, NY). Mediul a fost suplimentat cu 6 mL fiecare de aminoacizi esențiali minimi, penicilină/streptomicină (5000 U/mL/5000 µg/mL) și nistatină (10.000 U/mL; toate de la Life Technologies) la 500 mL de DMEM. Fracția albuminei serice bovine V, 4‐ (2 - hidroxietil) ‐1 - acid piperazinetansulfonic (HEPES), colagenază (Clostridium histolyticum, tip II; activitate specifică, 456 U/mg), insulină și metformină au fost achiziționate de la Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Matricea Matrigel a fost achiziționată de la Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ). Bis (maltolato) oxovanadiu (IV) (BMOV), o formă organizată de vanadiu (31), a fost un cadou de la Dr. John McNeill și Violet Yuen, Departamentul de Științe Farmaceutice, Universitatea British Columbia, Vancouver, BC, Canada. Plăcile Falcon cu șase sonde au fost achiziționate de la Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Filtre din nailon au fost achiziționate de la Tetko (Kansas City, MO).

Animale

Șobolanii Sprague - Dawley masculi (cu vârsta cuprinsă între 3 și 6 luni) au fost obținuți de la Charles River (Wilmington, MA). Animalele au fost adăpostite în cuști de sârmă suspendate în camere cu temperatură controlată (22 ° C), cu un ciclu de lumină - întuneric de 12 ore și au fost hrănite cu dietă Purina chow (Ralston - Purina, St. Louise, MO) și li s-a dat apă deionizată ad libitum. Utilizarea și îngrijirea animalelor a fost în conformitate cu Ghidul Institutului Național de Sănătate pentru Utilizarea și Îngrijirea Animalelor de Laborator și a fost efectuată în facilități acreditate de Asociația Americană pentru Acreditarea Îngrijirii Animalelor de Laborator. Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul administrativ de utilizare și îngrijire a animalelor de la Universitatea din California, Davis.

Metode

Izolarea/prepararea celulei.

Adipocitele au fost preparate din tampoane de grăsime epididimale de la șobolani Sprague-Dawley masculi cu o greutate de 300 până la 600 g. Depozitele de grăsimi epididimale au fost resecate de la șobolani anotanizați cu halotan în condiții aseptice, iar adipocitele au fost izolate prin digestia colagenazei prin metoda Rodbell ((32)) cu modificări minore așa cum s-a descris anterior ((28)). Adipocitele izolate au fost apoi incubate timp de 30 de minute la 37 ° C înainte de a fi placate și cultivate pe plăci acoperite cu Matrigel.

Cultura adipocitelor.

Analize.

Concentrațiile de leptină în mediu au fost determinate cu o radioimunologie sensibilă și specifică pentru leptina de șobolan ((37)) cu reactivi obținuți de la Linco Research, St. Charles, MO. Glucoza și lactatul au fost măsurate cu un analizor de glucoză (modelul 2300, YSI, Yellow Springs, OH).

Analiza datelor.

Deoarece metformina a prezentat efecte toxice asupra metabolismului adipocitelor la concentrații mai mari de 5,0 mM, rezultatele din culturile incubate cu metformină la concentrații mai mari de 5,0 mM nu au fost incluse în aceste analize. Relația dintre producția de lactat din secreția de glucoză și leptină a fost, de asemenea, examinată numai în grupurile de control. Datele sunt exprimate ca mijloace + SEM.

Rezultate

Efectele metforminei

Au fost examinate efectele metforminei asupra absorbției glucozei, producției de lactat și secreției de leptină. Metformina la o concentrație de 0,1 mM nu a afectat absorbția glucozei în comparație cu suspensiile martor corespunzătoare care conțin insulină (0,16 nM) singură. La 0,25 mM, absorbția glucozei a crescut (% Δ = +9 ± 8%), dar efectul nu a fost semnificativ statistic, probabil din cauza numărului mai mic de studii (n = 5) efectuate la această concentrație. Metformina a stimulat absorbția glucozei la concentrații de 0,5 mM (+37 ± 10%, p Tabelul 1. Efectele metforminei în prezența insulinei 0,16 nM asupra absorbției de glucoză, producției de lactat și procentului de glucoză carbon preluat care a fost eliberat sub formă de lactat de către adipocitele de șobolan izolate timp de 96 de ore în cultură (medie ± SEM)

[Metformin] (mM) + insulină (0,16 nM) Absorbția glucozei (μmol) în 96 de ore Producția de lactat (μmol) în 96 de ore Glucoză în lactat (%)
Control (n = 18) 7,5 ± 0,7 5,7 ± 0,5 40,9 ± 3,6
0,1 (n = 4) 6,5 ± 0,9 5,9 ± 0,6 47,2 ± 6,3
0,25 (n = 5) 11,0 ± 1,4 8,6 ± 1,3 40,2 ± 5,9
0,5 (n = 9) 11,0 ± 1,2 † 9,5 ± 1,2 † 44,9 ± 5,1
1.0 (n = 18) 11,6 ± 0,7 ‡ 14,4 ± 0,9 ‡ 63,8 ± 3,4 *
5.0 (n = 15) 8,3 ± 0,6 14,4 ± 1,0 ‡ 85,6 ± 4,1 ‡

  • * p = 0,01
  • † p = 0,005
  • ‡ p = 0,0005; vs. controale corespunzătoare din aceleași suspensii de adipocite.

Utilizarea glucozei (corectată pentru eșantionarea și înlocuirea mediilor) timp de 96 de ore de către adipocite de șobolan izolate în cultură primară cu insulină la 0,16 nM și metformină la concentrații de la 0 la 25,0 mM.

La concentrații de metformină mai mici de 0,5 mM, secreția de leptină nu a fost afectată. Cu metformină la 0,5 mM, aria de sub curbă (ASC) pentru secreția de leptină timp de 96 de ore a fost semnificativ mai mare (+20,5 ± 9%)., p

Secreția de leptină (corectată pentru eșantionarea și înlocuirea mediilor) timp de 96 de ore de către adipocite de șobolan izolate în cultură primară cu insulină la 0,16 nM și metformină la concentrații de la 0 la 25,0 mM.

În cele 18 godeuri de control, secreția de leptină a fost invers legată de conversia glucozei în lactat (r = −0,61; p

Relația dintre procentul de glucoză preluat și eliberat ca secreție de lactat și leptină timp de 96 de ore de către adipocite în cultură primară cu insulină (INS) la 0,16 nM și metformină (MET) la concentrații de la 0 la 5,0 mM. Secreția de leptină, utilizarea glucozei și producția de lactat sunt corectate pentru eșantionarea și înlocuirea mediilor.

Relația dintre procentul de glucoză preluat și eliberat sub formă de secreție de lactat și leptină timp de 96 de ore de către adipocite în cultura primară în 32 de godeuri de control care nu conțin insulină adăugată sau insulină la o concentrație scăzută de 0,16 nM. Secreția de leptină, utilizarea glucozei și producția de lactat sunt corectate pentru eșantionarea și înlocuirea mediilor.

Efectele vanadiului

Efectele vanadiului asupra absorbției glucozei, producției de lactat și secreției de leptină au fost examinate la adipocite cultivate cu concentrații de vanadiu de la 0 la 50 μM. Vanadiu la 5,0 μM (+20 ± 7%), p Tabelul 2. Efectele insulinei (1,6 nM) sau vanadiului asupra absorbției de glucoză, producției de lactat și procentului de glucoză carbon preluat care a fost eliberat ca lactat de către adipocitele izolate de șobolan peste 96 de ore în cultură (medie ± SEM)

[Vanadiu] (μM); fără insulină adăugată Absorbție de glucoză (μmol) peste 96 de ore Producția de lactat (μmol) peste 96 de ore Glucoză la lactat (%)
Control (n = 14) 6,8 ± 0,5 5,6 ± 0,6 42,4 ± 4,3
1,6 nM Ins (n = 14) 9,4 ± 0,9§ 5,7 ± 0,7 33,0 ± 3,5 ‡
5.0 (n = 12) 7,8 ± 1,1§ 5,7 ± 0,6 * 40,5 ± 4,7
10,0 (n = 6) 8,2 ± 1,3 ‡ 5,2 ± 0,8 † 36,0 ± 6,5
20,0 (n = 12) 8,7 ± 1,2 ‡ 6,3 ± 0,6 41,6 ± 5,0
50,0 (n = 13) 6,9 ± 1,02 4,9 ± 0,5 53,3 ± 9,4
  • * p = 0,05
  • † p = 0,02
  • ‡ p = 0,0025
  • § p = 0,0005; vs. godeuri de control corespunzătoare din aceleași suspensii de adipocite.

Utilizarea glucozei (corectată pentru eșantionarea și înlocuirea mediilor) peste 96 de ore de către adipocite de șobolan izolate în cultură primară cu vanadiu la concentrații de la 0 la 50,0 μM sau cu insulină la 1,6 nM.

Insulina la 1,6 nM a crescut secreția de leptină în 96 de ore cu 59 ± 15% (p

Secreția de leptină (corectată pentru eșantionarea și înlocuirea mediilor) timp de 96 de ore de către adipocite de șobolan izolate în cultură primară cu vanadiu la concentrații de la 0 la 50,0 μM sau cu insulină la 1,6 nM.

Discuţie

În prezentul studiu, concentrațiile de metformină variind de la 0,5 la 5,0 mM au crescut atât absorbția glucozei, cât și producția de lactat. Pe lângă creșterea producției absolute de lactat, metformina la 1,0 și 5,0 mM a crescut procentul de glucoză carbon care a fost metabolizat în lactat și eliberat în mediul de cultură cu 80% până la 170%. La concentrații mari de metformină (= 25,0 mM), atât absorbția glucozei, cât și producția de lactat au fost inhibate semnificativ, cel mai probabil datorită efectului toxic al nivelurilor foarte ridicate de metformină asupra metabolismului celular. Metformina la 0,5 mM a crescut modest secreția de leptină cu ~ 20%.

Foarte important, aceasta a fost singura concentrație de metformină testată care a crescut absorbția de glucoză, fără a trece o proporție mai mare de glucoză în producția de lactat. În schimb, la concentrații de 1,0 mM și mai mari, secreția de leptină a fost modestă până la suprimată semnificativ.

Metformina la 0,1 și 0,25 mM nu a afectat metabolismul glucozei sau secreția de leptină. Astfel, este puțin probabil ca metformina la niveluri terapeutice să afecteze producția de leptină in vivo. Dintre concentrațiile de metformină testate în acest studiu, doar 0,5 mM a crescut absorbția glucozei fără a transfera o proporție mai mare de glucoză în lactat. După cum sa discutat anterior, aceasta a fost singura concentrație de metformină care a avut efecte asupra metabolismului glucozei care nu inhibă secreția de leptină și, de fapt, secreția de leptină a crescut modest la 0,5 mM. Astfel, numai atunci când absorbția glucozei și metabolismul său dincolo de lactat a fost crescut simultan, am observat o creștere și nu o inhibare a secreției de leptină. Prin urmare, se pare că numai într-un interval de concentrație foarte restrâns, metformina poate avea un efect net de creștere a absorbției glucozei, precum și a metabolismului acesteia dincolo de lactat în adipocite izolate. În consecință, efectele metforminei pentru a inhiba secreția de leptină la cele mai multe concentrații examinate este probabil rezultatul efectelor sale de a direcționa metabolismul piruvatului în lactat și de la alte căi potențiale pentru metabolismul piruvatului, cum ar fi oxidarea sau lipogeneza.

Utilizarea compușilor care conțin vanadiu în tratamentul diabetului a fost investigată pe scară largă la animale ((52), (53)), iar câteva studii clinice au fost efectuate la pacienți umani ((54), (55)). Un compus similar structural cu forma de vanadiu organizat utilizat în acest studiu (BMOV) a intrat recent în studiile clinice de fază 1. Din câte știm, prezentul studiu este primul raport care examinează efectele unui compus de vanadiu asupra producției de leptină in vivo sau in vitro.

Vanadiul a stimulat absorbția glucozei la concentrații de până la 20 μM, în timp ce absorbția glucozei nu a fost afectată de o concentrație de 50 μM. Producția de lactat a crescut modest la concentrațiile mai mici de vanadiu. Am constatat că vanadiul la o concentrație scăzută de 5,0 μM nu a afectat producția de leptină, cu toate acestea, concentrațiile de 10,0 μM și secreția de leptină mai mare inhibată din adipocite izolate cu 30% până la 60%. Deși cantitatea de leptină secretată a fost invers proporțională cu procentul de conversie a glucozei în lactat în concentrațiile de vanadiu testate, această relație a fost semnificativ mai slabă decât cea observată la concentrațiile de metformină.

Mai mult, proporția de glucoză preluată și eliberată ca lactat nu a fost afectată de vanadiu la nicio concentrație. Astfel, spre deosebire de ceea ce s-a observat cu metformina, capacitatea vanadiului de a inhiba secreția de leptină pare să fie independentă de orice efect asupra metabolismului glucozei sau al producției de lactat, cel mai probabil deoarece nu crește proporția de glucoză care se transformă în metabolismul anaerob.

Efectele observate ale vanadiului rezultă din una sau mai multe dintre multiplele acțiuni biologice cunoscute ale vanadiului în celule. Acestea includ inhibarea proteinelor tirozin fosfatazelor și activarea proteinelor citosolice - tirozin kinaze, rezultând modificarea conținutului de fosforilare a tirozinei celulare ((30), (56)). De asemenea, s-a demonstrat că vanadiul exercită efecte inhibitorii directe asupra unui număr de alte enzime celulare, inclusiv fosfatazele acide, alcaline și cu funcție dublă, ATPazele, glucoza - 6 - fosfataza și fructoza - 2,6 - bisfosfataza (30), ( 55)). La concentrații mari, vanadiul ar putea exercita unele efecte toxice asupra celulelor, efect care ar putea sta la baza lipsei efectului celei mai mari concentrații de vanadiu pentru a stimula absorbția glucozei, precum și a inhibării producției de leptină la cele două concentrații cele mai mari examinate. În special, efectele vanadiului de a inhiba activitatea uneia sau mai multor enzime implicate în metabolismul energiei celulare ar putea inhiba atât producția de leptină, cât și, la concentrații mari, afectează capacitatea celulei de a utiliza energia derivată din metabolismul glucozei.

La animalele tratate cu vanadiu, concentrațiile plasmatice de vanadiu s-au estimat a fi în intervalul 10-20 μM și în studiile clinice la om în intervalul 1-5 μM (53). Deși este puțin probabil pe baza rezultatelor actuale că concentrația de vanadiu atinsă la om ar fi suficientă pentru a afecta producția de leptină, studiile anterioare la om au folosit doze mici de vanadil sulfat sau metavanadat de sodiu, care sunt forme moleculare care prezintă o biodisponibilitate slabă. Prin urmare, ar trebui luate în considerare efectele potențiale asupra secreției de leptină a formelor mai ușor absorbite de vanadiu, cum ar fi compusul organizat de vanadiu (BMOV) utilizat în prezentul studiu (31).

Pe scurt, atât metformina cât și vanadiul inhibă secreția de leptină din culturile primare de adipocit de șobolan la concentrații care cresc semnificativ utilizarea glucozei. Inhibarea producției de leptină de către metformină, dar nu de vanadiu, este legată de o conversie crescută a glucozei în lactat (adică, metabolism anaerob). Acest efect al metforminei, împreună cu constatările noastre anterioare (28)), sugerează că efectul utilizării glucozei pentru a stimula producția de leptină nu este mediat de absorbția glucozei în sine, ci implică metabolismul glucozei dincolo de piruvat la o altă soartă decât lactatul, posibil oxidare sau lipogeneză. Astfel, metformina este un instrument util pentru examinarea efectelor creșterii metabolismului anaerob al glucozei. Cercetări suplimentare, inclusiv examinarea rolurilor potențiale ale oxidării și lipogenezei glucozei, trebuie efectuate pentru a determina mecanismele biochimice și moleculare precise prin care metabolismul glucozei reglează producția de leptină.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută parțial de subvențiile NIH DK - 50129 și DK - 35747, Fundația pentru diabet juvenil, Asociația Americană pentru Diabet și Departamentul pentru Agricultură al Statelor Unite. Mulțumim doctorilor. John McNeill și Violet Yuen, în cadrul Departamentului de Științe Farmaceutice, Universitatea British Columbia, Vancouver, BC, Canada, pentru furnizarea generoasă de BMOV utilizat în studiu.