Abstract

leptina, un hormon produs predominant în adipocite, are efecte profunde asupra consumului de alimente, consumului de energie și metabolismului (1, 7, 22, 36, 52, 54, 66). Concentrațiile plasmatice de leptină sunt corelate pozitiv cu diferiți indici de grăsime, cum ar fi masa totală de grăsime corporală, procentul de grăsime corporală și indicele de masă corporală, atât la oameni, cât și la rozătoare (10, 17, 32, 44, 51), sugerând că leptina poate funcționa ca semnal umoral al masei grase ca parte a unui mecanism de reglare a echilibrului energetic (29, 53).

asupra

Expresia ARNm de leptină și secreția de proteine ​​sunt reglate de mulți factori, inclusiv insulină, glucocorticoizi, catecolamine și TNF-α (6, 47, 48, 55, 61). Postul suprimă în mod acut expresia genei leptinei, iar hrănirea restabilește expresia mARN-ului leptinei la niveluri care nu postesc în 4-7 ore (5, 41, 48). Efectele postului și hrănirii asupra nivelurilor de ARNm ale leptinei sunt parțial mediate de concentrația circulantă a insulinei și de efectele insulinei asupra metabolismului adipocitelor (38, 48). Am arătat anterior că nivelurile de ARNm de leptină și ratele de secreție de proteine ​​sunt puternic corelate între ele și cu volumul adipocitelor în depozitele de grăsime inghinale, perigonadale și retroperitoneale ale șoarecilor tineri slabi în starea postabsorptivă (C57BL/6J masculin de 10 săptămâni ). Pante ale liniilor de regresie care leagă nivelul mARN de leptină tisulară cu volumul mediu de adipocite sunt ușor mai mari în perigonadal decât în ​​depozitele de grăsime inghinale și retroperitoneale, iar volumul adipocitelor reprezintă 64% din variația nivelurilor de mARN de leptină tisulară la acești șoareci ( 65). Aceste rezultate oferă o bază mecanicistă pentru rolul fiziologic al leptinei ca semnal umoral al masei grase.

Deși concentrațiile plasmatice de leptină sunt în general mai mari la obezii decât la oamenii slabi, concentrațiile plasmatice de leptină pe unitate de masă grasă par să fie mai împrăștiate și posibil mai mici, la oamenii mai în vârstă și obezi comparativ cu subiecții cu greutate normală, 50, 51). Mecanismul care stă la baza variației concentrației plasmatice de leptină pe unitate de masă grasă la oamenii obezi nu este clar. Concentrațiile plasmatice de leptină sunt, de asemenea, mai mari la obezi decât la șoareci slabi (17, 31). Cu toate acestea, relația precisă dintre expresia genei leptinei și mărimea adipocitelor în depozitele de grăsime anatomice distincte la șoareci obezi sau oameni nu este clară. Studiile sugerează că concentrația plasmatică de leptină pe unitate de masă grasă este un parametru important pentru homeostazia energetică la om și la rozătoare (4, 9, 42, 56, 57, 62, 63). Concentrațiile scăzute de leptină plasmatică pe unitate de masă grasă sunt asociate cu rate crescute de obezitate la indienii Pima și adipozități crescute la Grozav ob/+ șoareci (9, 42), în timp ce concentrațiile plasmatice ridicate de leptină pe unitate de masă grasă sunt asociate cu un fenotip slab și rezistență la obezitate indusă de dietă în mai multe modele de șoareci (4, 56, 57, 62, 63).

În acest raport, am examinat în mod sistematic relațiile dintre nivelul ARNm leptinei și volumul adipocitelor în depozite de grăsime anatomice distincte în patru modele de obezitate de la șoareci și am comparat rezultatele cu cele ale șoarecilor tineri slabi. Întrebările specifice pe care le-am pus sunt următoarele. 1) Nivelurile de ARNm de leptină pe unitate de volum de adipocite sunt similare între depozitele de grăsime anatomice distincte la șoareci obezi și similare cu cele ale șoarecilor tineri slabi? 2) Corelația pozitivă dintre nivelul ARNm de leptină și volumul adipocitelor se extinde de la adipocite mici la hipertrofice la șoareci obezi?

Colectarea probelor de animale și țesut adipos.

Izolarea și fracționarea mărimii adipocitelor.

Adipocitele au fost izolate prin digestia colagenazei așa cum s-a descris anterior (43). Pentru fracționarea mărimii, adipocitele izolate dintr-un singur strat de grăsime (0,5-1 g) au fost suspendate în 20 ml tampon bicarbonat Krebs-Ringer suplimentat cu 4% BSA și 1 g/l glucoză într-un tub conic de 50 ml și amestecate ușor. Adipocitele au fost apoi lăsate să plutească timp de 90 de secunde, iar celulele din 10 ml de tampon de jos au fost colectate (fracție de dimensiuni mici). Zece mililitri de tampon proaspăt au fost adăugați la adipocitele rămase. Celulele au fost amestecate și lăsate să plutească din nou timp de 30-45 s, și adipocitele din fundul de 10 ml de tampon au fost colectate (fracțiune de dimensiuni medii). În cele din urmă, adipocitele din top 5 ml de tampon au fost colectate după ce adipocitele rămase au fost amestecate din nou în 20 ml tampon și lăsate să plutească timp de 10-15 s (fracție de dimensiuni mari). O porțiune de adipocite din fiecare fracție a fost utilizată pentru a determina volumul celulei, iar celulele rămase au fost utilizate pentru prepararea ARN (vezi mai jos). Un rezultat reprezentativ, distribuțiile de mărime ale celor trei fracții de mărime adipocitelor din tamponul parametric de grăsime al unei femele de 3 luni ob/ob mouse-ul, este prezentat în Fig. 1.

FIG. 1.Graficul cu bare al valorilor medii și SE ale volumului adipocitelor (μg lipidă/celulă)A), nivelurile de ARNm pentru leptină (B) și TNF-α (C) (ca raporturi la β-actină, unități arbitrare) la țesuturile adipose inghinale (Ing), epididimale (Epi) și retroperitoneale (Ret) de la șoareci masculi C57BL/6J de 10 săptămâni, n = 30) (9), bărbat C57BL/6J de 10 săptămâni Grozav ob / Lep ob soareci (ob/ob, n = 10), mascul de 5 luni C57/BL/6J-A y soareci (A y, n = 5), șoareci masculi C57BL/6J de 11 luni, n = 6), și șoareci C57BL/6J hrăniți cu dietă bogată în grăsimi în vârstă de 8 luni, n = 5). Volumele adipocitelor, nivelurile de ARNm de leptină și nivelurile de ARNm de TNF-α au fost semnificativ diferite între modelele animale (P

Determinarea dimensiunii medii a adipocitelor țesuturilor adipoase și a dimensiunilor adipocitelor izolate.

Volumul mediu de adipocite al probelor de țesut adipos a fost determinat așa cum s-a descris anterior (3, 65). Volumele celulare de adipocite izolate au fost determinate utilizând o metodă microfotografică descrisă anterior de DiGirolamo (12) și Ashwell și colab. (3). Pe scurt, adipocitele colorate cu albastru de metilen au fost fotografiate la mărirea × 100 folosind un microscop cu lumină Nikon Eclipse E400 conectat la o cameră digitală și computer. Diametrele a cel puțin 200 de adipocite (identificate prin nucleele lor colorate) din fiecare probă au fost măsurate în microfotografii. Dimensiunea medie a adipocitelor (exprimată ca μg lipidă/celulă) dintr-o populație izolată de adipocite (sau o fracție de mărime) a fost calculată folosind formula Goldrick, volum = πd[3 (SD) 2 + d 2]/6, unde d este diametrul mediu al adipocitelor și SD este deviația standard a diametrelor adipocitelor, presupunând densitatea lipidelor = 0,915 g/ml (19).

Determinarea nivelurilor de mARN folosind RT-PCR cantitativ.

RT-PCR cantitativă utilizând β-actină ca control intern a fost utilizată pentru a determina nivelurile de ARNm de leptină, TNF-α și receptorul glucocorticoid așa cum s-a descris anterior (65). ARN-ul total a fost extras din țesut adipos sau adipocite izolate folosind reactiv TriZol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Aproximativ 1-5 μg de ARN total a fost transcris invers în ADNc folosind hexameri aleatori și transcriptază inversă M-MLV (Invitrogen). ADN-ul complementar a fost amplificat cantitativ prin PCR folosind primeri specifici pentru gena de interes în combinație cu primeri pentru β-actină pentru un număr limitat de cicluri care se aflau în intervalele de amplificare exponențială pentru ambele gene. Exemple de secvențe pentru leptină, TNF-α, receptor glucocorticoid și β-actină au fost raportate anterior (65), iar nivelurile de ARNm pentru genele de interes au fost exprimate ca un raport cu ARN-β-actină pentru a se normaliza pentru intrarea inițială de ARN.

Analize statistice.

FIG. 2.Relația dintre nivelul ARNm de leptină și dimensiunea medie a adipocitelor în țesuturile adipoase distincte din punct de vedere anatomic la șoarecii C57BL/6J masculi de 10 săptămâni (șoareci tineri slabi) (A și B) (11), mascul C57BL/6J de 10 săptămâni Grozav ob / Lep ob soareci (ob/ob), și șoareci masculi C57BL/6J de 11 luni (vechi)A), Șoareci masculi C57/BL/6J-A y de 5 luni (A y) și șoareci masculi C57BL/6J +/+ de 8 luni în dietă bogată în grăsimi (HFD) (B). Linia punctată prezintă linia de regresie pentru datele grupate de la depozitele de grăsime inghinale, epididimale și retroperitoneale ale șoarecilor tineri slabi (A și B).

Relațiile dintre nivelul ARNm de leptină și volumul adipocitelor într-un tampon de grăsime la șoarecii obezi.

Pentru a determina mecanismul care poate explica scăderile preferențiale ale nivelului de ARNm de leptină tisulară în raport cu volumul mediu de adipocite din depozitul de grăsime perigonadal al șoarecilor obezi, relația nivelurilor de ARNm de leptină și a volumului de adipocite într-un singur perigonadal și tampon de grăsime inghinală a fost examinat. Adipocite izolate din fiecare tampon de grăsime perigonadal sau inghinal de patru șoareci HFD și două femele C57BL/6J de 3 luni Grozav ob / Lep ob soareci (ob/ob) au fost separate în trei fracțiuni de mărime utilizând metoda de flotație descrisă în proiectele și metodele de cercetare. Figura 3 prezintă un rezultat reprezentativ al fracționării mărimii, adică distribuției mărimii a trei fracții de mărime adipocite derivate din tamponul parametric de grăsime al unei femele ob/ob șoarece. Diametrele (medie ± SD) pentru fracțiunile mari, medii și mici au fost de 92,6 ± 28,7, 67,0 ± 29,2 și 37,6 ± 20,4 μm, care corespund unui volum mediu de adipocite de 0,506, 0,225 și 0,048 μg lipide/celule, respectiv, și au fost semnificativ diferite (P

FIG. 3.Distribuția mărimii adipocitelor a 3 fracțiuni de dimensiuni izolate din tamponul parametric de grăsime al unei femele C57BL/6J de 3 luni Grozav ob / Lep ob mouse (ob1). Diametrul celulei este în μm. Bare deschise, fracțiune de dimensiuni mari (mari); bare gri, fracțiune de dimensiuni medii (Mediu) bare solide, fracțiune de dimensiuni mici (mici).

Nivelurile de ARNm pentru receptorul de leptină și glucocorticoizi (ca martor) și volumele medii de adipocite în fracțiile de mărime ale fiecărui tampon de grăsime au fost determinate și corelate între ele (Fig. 4). O corelație pozitivă între nivelul de ARNm de leptină și volumul de adipocite a fost prezentă în fiecare perigonadal și inghinal, dar pante ale liniilor de regresie au fost în mod constant mai mici în perigonadal decât în ​​inguinal, atât în ​​HFD cât și în ob/ob șoareci (datele de la 2 șoareci reprezentativi HFD sunt prezentate în Fig. 4A și 2 ob/ob șoareci din Fig. 4B). Nu s-a observat nicio corelație între nivelurile de ARNm ale receptorilor glucocorticoizi și volumul adipocitelor, fie în HFD, fie în ob/ob șoareci (Fig. 4, C și D, respectiv).

FIG. 4.Relația dintre nivelurile de ARNm de leptină și volumul adipocitelor (A și B) și între nivelurile de ARNm ale receptorilor glucocorticoizi (GR) și volumul adipocitelorC și D) în inghinal (cerc, Ing) sau perigonadal [pătrat, Epi la bărbați și parametrial (Pm) la femele] tampon de grăsime la doi șoareci C57BL/6J de vârstă de 8 luni, hrăniți cu diete (HFD1 și HFD2)A și C) și două femei C57BL/6J de 3 luni Grozav ob / Lep ob șoareci (ob1 și ob2) (B și D).

Au fost utilizate analize de regresie multiplă pentru a cuantifica efectele respective ale dimensiunii adipocitelor și ale depozitului de origine asupra nivelurilor de ARNm de leptină la șoarecii HFD (Tabelul 1). Într-un set de date combinat al fracțiilor de mărime de la ambele tampoane de grăsime inghinale și perigonadale ale celor patru șoareci HFD, volumul adipocitelor (P

tabelul 1. Analiza de regresie multiplă a efectelor dimensiunii adipocitelor și a depozitului de origine asupra nivelurilor de ARNm ale receptorilor de leptină și glucocorticoizi în fracțiunile de dimensiune adipocitară din tampoane de grăsime inghinale și perigonadale de la patru șoareci C57BL/6J masculi cu o dietă bogată în grăsimi de 8 luni

Variabilă dependentăNR 2 variabile independente Dimensiunea celulei Originea depozitului βPβPNivelul ARNm al leptinei240,660,82 y, Șoareci vechi și HFD. În plus, nivelurile de ARNm de leptină pe unitate de volum de adipocite au fost, de asemenea, scăzute la șoarecii A y și HFD comparativ cu cei ai șoarecilor tineri slabi. Contrar constatării la șoarecii tineri slabi (șoareci C57BL/6J în vârstă de 10 săptămâni) că nivelurile de ARNm de leptină pe unitate de volum de adipocite sunt ușor mai mari în perigonadal decât în ​​depozitele de grăsime inghinală (65), nivelurile de ARNm de leptină în raport cu volumul adipocitelor a fost semnificativ mai mic în perigonadal decât în ​​depozitele de grăsime inghinală la toți șoarecii obezi examinați. Împreună, aceste rezultate sugerează că obezitatea în sine, indiferent de etiologie, are efecte diferențiale asupra expresiei genei leptinei în depozite de grăsime anatomice distincte, rezultând niveluri mai mici de ARNm de leptină pe unitate de volum adipocit în perigonadal decât depozitele de grăsime inghinală la șoarecii obezi.

Această lucrare este susținută de un premiu pentru dezvoltarea carierei Asociației Americane a Diabetului, un premiu pentru pilot și fezabilitate de la New York Obesity Research Center (DK-26687) și Institutele Naționale de Granturi pentru Sănătate DK-63034 (R01), DK-64773 (R01), și DK-063068 (P30).