Abstract

  • ATGL, triglicerid lipazic adipos
  • BAY, 4-izopropil-3-metil-2- [1- (3- (S) -metil-piperidin-1-il) -metanoil] -2H-izoxazol-5-1
  • FFA, acid gras liber
  • HSL, lipază sensibilă la hormoni
  • KRBA, tampon bicarbonat Krebs-Ringer care conține albumină
  • MOME, 1 (3) -monooleoil-2-0-monooleil glicerol

Obezitatea, care se caracterizează printr-un exces de depozite de grăsimi, este cel mai important factor de risc pentru diabetul de tip 2. Lipoliza țesutului adipos duce la hidroliza trigliceridelor și la eliberarea acizilor grași liberi (FFA). Datorită legăturii dintre nivelurile crescute de FFA circulante și dezvoltarea rezistenței la insulină și a sindromului metabolic (1,2), lipoliza țesutului adipos constituie o țintă pentru industria medicamentelor. Acidul nicotinic, care acționează prin inhibarea lipolizei țesutului adipos, a fost primul agent de scădere a lipidelor utilizat pe scară largă (3). Catecolaminele și peptidele natriuretice sunt hormonii majori care stimulează această cale catabolică la om (4). Rezistența la lipoliza indusă de catecolamină în țesutul adipos subcutanat a fost demonstrată la adulți și copii obezi (5,6) și este atribuită scăderii expresiei β2-adrenoceptorilor lipolitici (7), proprietăților antilipolitice crescute ale α2-adrenoceptorilor (8) și scăderea expresiei lipazei hormon-sensibile (HSL) (9). Este posibil ca defectul HSL să fie cel mai important factor deoarece este observat și la rudele de gradul I neobeze la subiecții obezi (10) și pentru că există o relație pozitivă între capacitatea lipolitică și expresia HSL în celulele adipoase subcutanate umane (11).

lipolizei

Rolul limitării ratei HSL în lipoliza țesutului adipos a fost contestat de datele de la șoareci knockout HSL (12-15). Lipoliza indusă de catecolamină este abrogată, dar lipoliza bazală reziduală este observată la adipocite de la șoareci HSL-nul. Aceste date sugerează existența lipazelor non-HSL în țesutul adipos. Recent, a fost identificată o nouă trigliceridă lipază denumită triglicerid lipază adiposă (ATGL), desnutrin sau iPLA2ζ (16-18). Folosind anticorpi îndreptați împotriva ATGL, Zimmerman și colab. (16) sugerează că ATGL este responsabil pentru 75% din activitatea acilhyrolase citosolică în țesutul adipos alb al șoarecilor cu deficit de HSL. Prin urmare, ATGL ar putea participa împreună cu HSL la lipoliza țesutului adipos. Carboxilesteraza 3 (sau triacilglicerol hidrolaza) a fost parțial purificată din țesutul adipos alb de șoarece și s-a dovedit a avea activitate lipazică (19). Contribuția sa la lipoliză nu este cunoscută. Aici, am studiat contribuția relativă a HSL și a altor lipaze la lipoliza țesutului adipos și am căutat să stabilim dacă modificările lipolizei adipocitelor și ale expresiei HSL au fost prezente în obezitate.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Activități enzimatice lipazice.

O serie de (5- (2H) -izoxazolonil) uree a fost dezvoltată de Bayer ca inhibitori puternici ai HSL (20). Selectivitatea compusului 59 (4-izopropil-3-metil-2- [1- (3- (S) -metil-piperidin-1-il) -metanoil] -2H-izoxazol-5-onă), denumit în continuare BAY, a fost evaluat pe activitățile enzimatice ale preparatelor lipazice purificate folosind 1 (3) -monooleoil-2-0-monooleil glicerol (MOME) pentru HSL de șobolan și om, monoolein pentru lipaza monogliceridă de șoarece și trioleină pentru lipoproteina lipază bovină și lipaza pancreatică porcină ca substraturi (21.22). MOME este un analog al diacilglicerolului. Permite măsurarea activității diacilglicerol hidrolazei și nu este un substrat pentru monoacilglicerol lipaza. Celulele Cos7 au fost transfectate cu vectorii ATGL pcDNA3, pcDNA3-uman și pcDNA3-uman (17,23). Hidroliza trioleinei a fost măsurată pe extracte celulare.

Generarea și analiza șoarecilor nuli HSL.

Studiați cohorte.

O primă cohortă a inclus 14 bărbați obezi și 67 de femei obeze în vârstă de 36 ± 8 ani cu IMC 37 ± 5 kg/m 2 și 29 de femei neobeze și 13 bărbați neobezi în vârstă de 36 ± 9 ani cu IMC 24 ± 3 kg/m 2. Dimineața, după un post peste noapte, s-a obținut o probă de sânge venos pentru analiza leptinei serice, a insulinei plasmatice și a glucozei plasmatice (7,9,10); și o mare biopsie subcutanată a grăsimii (3-5 g) a fost obținută din regiunea abdominală prin aspirarea acului sub anestezie locală. O a doua cohortă a inclus 80 de femei obeze sănătoase cu IMC de 31-52 kg/m 2 și vârste cuprinse între 21 și 63 de ani. O a treia cohortă a inclus subiecți din studiul european multicentric NUGENOB (Interacțiuni nutrienți-gene în obezitatea umană; www.nugenob.org). Cele 24 de femei obeze aveau 31 ± 7 ani cu un IMC de 37 ± 5 kg/m 2. Cei de-al treilea subiecți ai cohortei au urmat un program de 10 săptămâni bazat pe o dietă cu restricție energetică, care furnizează 600 kcal sub cheltuielile totale zilnice de energie. După intervenția dietetică, IMC a scăzut la 34 ± 5 ​​kg/m 2 (P 80 obezi și 40 subiecți neobezi. Valorile sunt medii ± SD în text și medii ± SE în cifre. Datele au fost comparate de Wilcoxon, Mann- Testul Whitney sau Kruskal -Wallis.

REZULTATE

Efectul unui inhibitor al HSL asupra lipazelor și lipolizei.

Selectivitatea BAY pentru inhibarea HSL. A: Inhibarea concentrației-răspuns prin BAY a HSL uman purificat (hHSL) sau a șobolanului HSL (rHSL), lipazei pancreatice (PL), lipoprotein lipazei (LPL) și a lipozei monogliceride (MGL) activități enzimatice (n = 3). B: inhibarea BAY (10-6 mol/l) a activității trigliceridelor hidrolazice în celulele Cos7 care exprimă HSL uman sau ATGL uman (n = 3). C: inhibarea concentrației-răspuns de către BAY a activității trigliceridelor hidrolazice a extractului de țesut adipos de șoarece (n = 3). D: inhibarea BAY (10 −6 mol/l) a activității trigliceridelor hidrolazice în extracte de țesut adipos de tip sălbatic și HSL-nul (n = 4).

Lipoliza la adipocite izolate de la șoareci de tip sălbatic și HSL-nul. A: Eliberare de glicerol (n = 5). Curbele de concentrație-răspuns ale izoprenalinei au fost efectuate fără BAY (pătrate), cu BAY de 10 −8 mol/l (diamante) sau cu BAY de 10 −6 mol/l (triunghiuri). B: Eliberare de glicerol (n = 3). Inhibarea concentrației-răspuns a BAY a fost măsurată pe lipoliză indusă de 10-4 mol/l izoprenalină. C: eliberarea FFA (n = 3). Inhibarea concentrației-răspuns a BAY a fost măsurată pe lipoliză indusă de 10-4 mol/l izoprenalină.

Efectul BAY asupra lipolizei celulelor grase umane. A: Efecte antilipolitice ale BAY (▪, 10 −10 mol/l; □, 10 −7 mol/l), insulină (•, 10 −8 mol/l) și prostaglandină E2 (▵, 10 −5 mol/l )) pe eliberarea de glicerol indusă de izoprenalină. ○, curba doză-răspuns a izoprenalinei fără agenți antilipolitici (n = 4). B: Efectul BAY asupra eliberării glicerinei bazale (□), indusă de izoprenalină (○, 10-7 mol/l) și indusă de peptidă natriuretică atrială (▴, 10-7 mol/l) (n = 3). C: Inhibarea de către BAY (10 −5 mol/l) a glicerolului și a eliberării FFA induse de peptidă natriuretică (ANP, 10 −7 mol/l) bazală, indusă de isoprenalină (Iso, 10 −7 mol/l) (n = 6). D: inhibarea BAY (10 −6 mol/l) a activității hidrolazei trigliceridelor (trioleinei) și a digliceridelor (MOME) în extractele de țesut adipos uman (n = 4).

Expresia genelor HSL și ATGL în țesutul adipos uman.

Expresia genelor HSL și ATGL în țesutul adipos uman. Nivelurile de ARNm HSL și ATGL au fost cuantificate prin transcripție inversă cantitativă PCR și normalizate cu niveluri de ARNr 18S. A: Niveluri de ARNm HSL și ATGL în adipocite izolate și fracție stromavasculară (SVF) din țesutul adipos uman (n = 6). B: Exprimarea HSL, ATGL și proliferator peroxizom - receptor activat γ (PPARγ) mARN în timpul diferențierii preadipocite umane (n = 5). C: Relația dintre nivelurile de ARNm HSL și ATGL în țesutul adipos subcutanat de la 80 de femei obeze. D: Relația dintre variația ARNm HSL și ATGL în timpul unei diete hipocalorice în țesutul adipos subcutanat de la 24 de femei obeze. Nivelurile de ARNm HSL și ATGL au fost măsurate înainte și după o dietă hipocalorică de 10 săptămâni. Variațiile sunt calculate după cum urmează pentru fiecare individ: (nivelul de ARNm după dietă - nivelul de ARNm înainte de dietă)/nivelul de ARNm înainte de dietă.

Comparația subiecților nonobezi și obezi.

Lipoliza, secreția de leptină și expresia HSL la adipocite mature și preadipocite diferențiate de subiecți obezi și slabi. A: Eliberarea de glicerol și leptină în adipocite mature izolate de la 42 de subiecți slabi și 81 obezi. B: Eliberarea de glicerol și leptină în preadipocite diferențiate în cultura primară de la 42 de subiecți slabi și 81 obezi. C: Expresia proteinelor HSL și β2-adrenoceptorului (β2-AR) la preadipocite umane diferențiate de la 14 subiecți obezi și 7 subiecți slabi determinați prin analiza Western blot.

Pentru a afla dacă defectul lipolizei este primar sau secundar obezității, am folosit preadipocite preparate din aceleași biopsii ca și celulele adipoase mature. Fracțiunea de preadipocite care s-a diferențiat în adipocite a fost similară la subiecții nonobezi și la obezi: 60 ± 20% și respectiv 57 ± 18%. Dimensiunea celulelor a fost, de asemenea, similară la subiecții obezi și la cei neobezi: 1,8 ± 0,4 × 10 −9 m 2 și, respectiv, 1,5 ± 0,3 × 10 −9 m 2. Preadipocitele diferențiate au prezentat secreție similară de leptină la subiecții obezi și nonobezi, în timp ce lipoliza stimulată de noradrenalină și izoprenalină a fost redusă cu 60-70% la subiecții obezi (metode statistice P). Expresia HSL a fost redusă cu 60% în celulele de la subiecții obezi (Fig. 5C). Nu a existat nicio diferență între grupuri în expresia proteinei β2-adrenoceptorului.

DISCUŢIE

Model pentru căile stimulatoare în lipoliza țesutului adipos uman. Din motive de claritate, nu sunt prezentați modulatori neenzimatici importanți ai procesului lipolitic, cum ar fi perilipinele. AC, adenilil ciclaza; AR, adrenoceptor; DG, diglicerid; FA, acid gras; GC, guanilat ciclază; Gs, stimulatoare proteine ​​G; MG, monogliceride; MGL, monogliceride lipazice; NPRA, receptorul peptidic natriuretic A; PKA, protein kinaza A; PKG, protein kinaza G; TG, trigliceride.

Pe scurt, acest studiu demonstrează că HSL este lipaza principală care catalizează etapa de limitare a ratei în lipoliza stimulată la om, în timp ce ATGL participă la lipoliza bazală. Scăderea lipolizei indusă de catecolamină, dar nu producția de leptină în țesutul adipos subcutanat al subiecților obezi este un defect precoce, posibil primar, care este legat de scăderea expresiei proteinelor de HSL.

Mulțumiri

Acest studiu a primit sprijin de la Consiliul Suedez de Cercetare, Programul Național de Căutare în Nutriție Humaină, Asociația Suedeză pentru Diabet, Fundația Novo Nordic, Fundația Suedeză pentru Inimă și Plămân, Fundația Bergvall, Fundația Tore Nilsson, Regele Gustaf V și Fundația Queen Victoria și programele NUGENOB (interacțiuni nutrienți-gene în obezitatea umană) și HEPADIP (țesut hepatic și adipos în sindromul metabolic) susținute de Comisia Europeană (contract nr. QLK1-CT-2000-00618).

Mulțumim Dr. Max Lafontan (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U586) pentru comentarii valoroase asupra manuscrisului. Mulțumim și dr. Kevin Clairmont și Derek Lowe (Bayer) pentru donația BAY și a prof. Gunilla Olivecrona (Universitatea Umeå) și Charlotte Erlanson-Albertsson (Universitatea Lund) pentru furnizarea de preparate purificate de lipoproteină lipază bovină și respectiv lipază pancreatică porcină. Este apreciată asistența tehnică abilă a lui Gaby Åström, Katarina Hertel, Britt-Marie Leijonhufvud, Eva Sjölin, Kerstin Wåhlen, Cécile Rieu, Marie-Adeline Marques, Birgitta Danielsson și Ann-Helen Thorén.