Vu Minh Thanh

1 Institutul de Chimie și Materiale, 17 Hoang Sam, Cau Giay, Hanoi 100000, Vietnam; moc.oohay@222hnahtmv

Minh City

Le Minh Bui

2 NTT Hi-Tech Institute, Universitatea Nguyen Tat Thanh, 300A Nguyen Tat Thanh, District 4, Ho Chi Minh City 700000, Vietnam; nv.ude.ttn@hnimlb (L.M.B.); nv.ude.ttn@gnaiglb (L.G.B.)

Long Giang Bach

2 NTT Hi-Tech Institute, Universitatea Nguyen Tat Thanh, 300A Nguyen Tat Thanh, District 4, Ho Chi Minh City 700000, Vietnam; nv.ude.ttn@hnimlb (L.M.B.); nv.ude.ttn@gnaiglb (L.G.B.)

3 Centrul de excelență pentru polimeri funcționali și nanotecnologie, Universitatea Nguyen Tat Thanh, Ho Chi Minh City 700000, Vietnam

Ngoc Tung Nguyen

4 Centre for Research and Technology Transfer (CRETECH), Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay District, Hanoi 100000, Vietnam; [email protected]

Hoa Le Thi

5 Grupul de cercetare a biomaterialelor și nanotehnologiei, Facultatea de Științe Aplicate, Universitatea Ton Duc Thang, Ho Chi Minh City 758307, Vietnam; [email protected]

Thai Thanh Hoang Thi

5 Grupul de cercetare a biomaterialelor și nanotehnologiei, Facultatea de Științe Aplicate, Universitatea Ton Duc Thang, Ho Chi Minh City 758307, Vietnam; [email protected]

Abstract

În acest studiu, introducerea uleiului esențial Origanum majorana L. într-un poliamidoamină (PAMAM) G4.0 dendrimer a fost realizată pentru crearea unui potențial nanocid împotriva Phytophthora infestans. Caracteristicile uleiului de maghiran și PAMAM G4.0 au fost analizate utilizând spectroscopia electronică de transmisie (TEM), spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară (1 H-RMN) și spectrometria de masă prin cromatografie în gaze (GC-MS). Succesul combinării uleiului de maghiran cu PAMAM G4.0 a fost evaluat prin FT-IR, analiză TGA și a fost investigată și activitatea antifungică a acestui sistem. Rezultatele au arătat că activitatea antifungică a uleiului/PAMAM G4.0 a fost ridicată și semnificativ mai mare decât doar PAMAM G4.0 sau uleiul esențial de maghiran. Aceste rezultate au indicat faptul că uleiul de nanocid/PAMAM G4.0 a contribuit la întărirea și prelungirea proprietăților antifungice ale uleiului.

1. Introducere

În Vietnam, roșiile se clasează pe locul zece în ceea ce privește valoarea culturilor, depășind peste 9,7 miliarde VND în 2005. Cu toate acestea, boala târzie a roșiilor, cauzată de Phytophthora infestans, este o boală distructivă care determină scăderea severă a producției de roșii de mulți ani. Potrivit Oficiului General de Statistică al Vietnamului, răul târziu cauzat de Phytophthora infestans a împiedicat drastic creșterea suprafeței de cultivare a roșiilor în Vietnam din 2009 până în 2012, rezultând într-o oprire a producției [1]. Studii privind distribuția, precum și efectele bolii târzii au fost, de asemenea, efectuate foarte devreme. Potrivit evaluării prejudiciului cauzat de răul târziu în suburbiile din Hanoi în 1965, pierderea medie de 30-70%, la nivel ridicat, poate provoca o pierdere completă a productivității. În ultimii ani, nivelul bolii este încă ridicat. În multe suburbii din Vietnam s-au observat focare severe de rău târziu [1,2].

Acest studiu a încercat combinarea uleiului esențial de maghiran cu PAMAM G4.0 pentru a produce sistemul de ulei/PAMAM G4.0 dendrimer. Sistemul a fost apoi evaluat pentru eficiența conservării funcțiilor uleiului natural și testat pentru activitatea antifungică împotriva P. infestans. Structura polimerului și morfologia PAMAM G4.0 au fost caracterizate. Au fost de asemenea analizate analiza TGA și spectrul FT-IR al PAMAM G4.0 care conține acest ulei volatil.

2. Materiale și metode

2.1. Materiale

Etilendiamina (EDA) și toluenul au fost achiziționate de la Merck (Darmstadt, Germania). Acrilatul de metil (MA) a fost achiziționat de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Metanolul a fost furnizat de Fisher Scientific (Houston, TX, SUA). Membrana de dializă Spectra/Por ® (MWCO 3,5 kDa) a fost achiziționată de la Spectrum Laboratories Inc. (Rancho Dominguez, CA, SUA). Uleiul esențial de maghiran a fost furnizat de Institutul Hi-Tech NTT, Universitatea Nguyen Tat Thanh, Ho Chi Minh City, Vietnam. Tulpina de ciuperci pentru infestații Phytophthora a fost achiziționată de la Gia Tuong Ltd, Vietnam. Etanolul și acidul acetic au fost achiziționate de la Xilong Chemical, Ltd. (Guangdong, China). Toate celelalte substanțe chimice au avut un grad de reactiv. Apa distilată a fost utilizată în toate preparatele.

2.2. Metode

2.2.1. Pregătirea PAMAM G4.0 Dendrimer

Generarea PAMAM dendrimer 4.0 (PAMAM G4.0) a fost sintetizată din nucleul EDA utilizând abordarea divergentă, așa cum sa raportat anterior în literatura noastră [13], în care grupurile aminice primare ale EDA reacționează cu grupările acrilate ale MA prin reacția de adăugare Michael pentru a forma jumătate de generație PAMAM, urmată de reacția dintre grupările de metil propionat PAMAM de jumătate de generație cu exces de EDA pentru a forma dendrimer PAMAM de generație completă, notat cu Gn.0. Pe scurt, EDA (20 ml) a fost adăugat la 150 ml de MA dizolvat în metanol. Reacția a fost la rândul său menținută sub agitare timp de 3 h la 0 ° C și apoi 48 h la temperatura camerei. Îndepărtarea impurităților și solventului a fost efectuată folosind un evaporator rotativ cu vid (Strike 300, Lancashire, Marea Britanie), rezultând precursorul central G0.5. Apoi, G0.5 a fost adăugat la soluția EDA (130 ml) pentru a obține PAMA G0.0. Amestecul a fost agitat timp de 96 h la temperatura camerei, rotit sub vid folosind solvent amestecat (toluen: metanol este de 9: 1 v/v). În cele din urmă, amestecul rezultat a fost dializat prin membrană de dializă împotriva metanolului pentru a îndepărta excesul de toluen și EDA și a fost uscat sub vid pentru a elimina metanolul. Acest protocol a fost repetat continuu pentru a obține PAMAM G4.0.

2.2.2. Caracteristicile PAMAM G4.0 Dendrimer

Structura chimică a dendrimerului PAMAM G4.0 a fost analizată utilizând spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară (Bruker Advance 500, Bruker Co., Billerica, MA, SUA). Cloroformul deuterat a fost utilizat ca solvent. Pentru ilustrarea dimensiunii și morfologiei, a fost utilizată spectroscopia electronică de transmisie (JEM-1400 TEM; JEOL, Tokyo, Japonia). O picătură de soluție de probă preparată în apă distilată a fost plasată pe o rețea de carbon - cupru (300-mesh, Ted Pella Inc., Redding, CA, SUA) și uscată la aer în 10 minute pentru observarea TEM.

2.2.3. Evaluarea compoziției uleiului esențial de maghiran

Compoziția uleiului de maghiran a fost determinată prin spectrometrie de masă prin cromatografie cu gaze (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA).

2.2.4. Sinteza PAMAM G4.0 Combinând ulei esențial de maghiran

Un sistem rotativ a fost utilizat pentru a scurge tot vaporii de apă din dendrimerul PAMAM G4.0 pentru a se asigura că PAMAM G4.0 este complet uscat. Uleiul esențial de maghiran (500 μg, 1000 μg, 2000 μg și 5000 μg) a fost adăugat rapid la PAMAM G4.0 conform raporturilor (1: 1). După ultrasunete timp de 15 minute la temperatura camerei, probele au fost rotite la 100 ° C timp de 2 minute, permițând moleculelor de ulei să se combine cu structura dendrimerului. Probele au fost depozitate în frigider pentru utilizare ulterioară.

2.2.5. Caracterizarea uleiului/PAMAM G4.0

Uleiul de maghiran, PAMAM G4.0 și sistemul combinat au fost analizate cu Spectrum Tensor27 FT-IR Spectrometer, utilizând pelete KBr Spectrometru FT-IR în intervalul 400-4000 cm −1. Toate probele au fost amestecate cu KBr și presate într-o peletă înainte de măsurare. Analiza gravimetrică termică (TGA) a uleiului esențial de maghiran, PAMAM și ulei/PAMAM au fost efectuate folosind TG Analyzer (Mettler Toledo, Culumbus, OH, SUA).

2.2.6. Metoda de difuzie a agarului

Efectul antifungic al uleiului de maghiran, PAMAM G4.0 și al sistemului au fost evaluate utilizând metoda de difuzie a agarului. Plăcile de agar PDA (Potato Dextrose Agar) au fost preparate prin infuzie de cartof la 250,00 g/L, glucoză la 20,00 g/L și agar la 20,00 g/L. După aceea, soluția fungică a fost preparată și a obținut densitatea de 6,0465 × 108 CFU/ml după 48 de ore de incubare. Soluția a fost apoi diluată de 2 ori, urmată de inocularea a 100 uL soluție fungică diluată pe suprafața agarului. Cantitatea adecvată de probă sintetică de ulei/PAMAM a fost dizolvată mai întâi în 1 ml de apă distilată pentru a obține concentrația finală dorită, care sunt 500 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm și 5000 ppm. Apoi, s-au adăugat 100 pl de soluție de probă la fiecare godeu cu diametrul de 6 mm. După 48 de ore, zona de inhibare a fost măsurată în diametru. Datele au fost exprimate ca medie ± SD.

3. Rezultate si discutii

Pregătirea generației 4.0 de dendrimer PAMAM (G4.0) a fost obținută din nucleul inițiator EDA utilizând sinteza în doi pași în care etapele impare produc jumătate de generație PAMAM urmate de pași pari care generează dendrimer PAMAM de generație completă.

3.1. Structura chimică a dendrimerului sintetizat PAMAM G4.0

Spectrul protonului 1H RMN al PAMAM G4.0 este prezentat în Figura 1. Așa cum se arată în Figura 1, protonii la 2,351 ppm, 2,55 ppm, 2,77 ppm, 3,04 ppm și 3,23 ppm au fost repartizați protonilor în grupuri de metilen de –CH2 - CO - NH (vârf d), CH2 - N– (vârf b), –CH2 - NH2– (vârful a), –N - CH2 - CH2– (vârful e) și –CO - NH - CH2 (vârful c). Prezența tuturor acestor semnale a demonstrat că PAMAM G4.0 a fost sintetizat și caracterizat cu succes pe baza altor studii în caracterizarea RMN a generației a patra PAMAM [13,16].