Abstract

OBIECTIV Caracterizarea modificărilor fenotipice ale macrofagelor de țesut adipos (ATM) în diferite condiții de sensibilitate la insulină.

reglementare

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII Numărul și expresiile genelor marker pentru macrofagele M1 și M2 din țesutul adipos epididimal de șoarece au fost analizate folosind citometrie în flux după ce șoarecii au fost supuși unei diete bogate în grăsimi (HFD) și tratament cu pioglitazonă.

REZULTATE Majoritatea macrofagelor M1 CD11c-pozitive și macrofagelor M2 CD206-pozitive din țesutul adipos epididimal au fost separate în mod clar folosind citometrie de flux. Macrofagele M1 și M2 au prezentat modele de exprimare a genelor complet diferite. Nu numai numărul ATM-urilor M1 și expresia genelor marker M1, cum ar fi factorul de necroză tumorală-α și proteina-1 chimiotratantă a monocitelor, dar și raportul M1-la-M2 au fost crescute cu un HFD și scăzute prin tratamentul ulterior cu pioglitazonă, sugerând corelația cu sensibilitatea la insulină a întregului corp. De asemenea, am constatat că numărul crescut de ATM-uri M2 după un HFD a fost asociat cu expresia reglată în sus a interleukinei (IL) -10, o citokină antiinflamatorie Th2, în fracția adipocitelor, precum și în țesutul adipos. Supraexprimarea sistemică a IL-10 de către un vector adenovirus a crescut expresia markerilor M2 în țesutul adipos.

CONCLUZII Bancomatele M1 și M2 constituie diferite subseturi de macrofage. Rezistența la insulină este asociată atât cu numărul de macrofage M1, cât și cu raportul M1-la-M2. Expresia crescută a IL-10 după un HFD ar putea fi implicată în recrutarea crescută a macrofagelor M2.

Obezitatea și rezistența la insulină sunt strâns asociate cu o stare de inflamație de grad scăzut în țesutul adipos, unde macrofagele rezidente joacă roluri importante (1-9). Macrofagele de țesut adipos (ATM) constau din cel puțin două fenotipuri diferite (adică, macrofage M1 activate clasic și macrofage M2 activate alternativ). Un raport recent (10) propunea că ATM-urile M1 sau M2 se disting prin prezența sau absența CD11c, un marker macrofagic M1. ATM-urile M1 produc citokine proinflamatorii, cum ar fi factorul de necroză tumorală (TNF) -α, interleukina (IL) -6 și proteina chimiotratantă monocitară (MCP) -1, contribuind astfel la inducerea rezistenței la insulină (11-13). Pe de altă parte, ATM-urile M2, care sunt principalele macrofage rezidente din țesutul adipos slab, au fost raportate că au un profil de expresie genetic diferit, caracterizat prin expresia relativ ridicată a CD206, arginază-1, MglI și IL-10, care sunt implicate în repararea sau remodelarea țesuturilor (10-14).

Studii recente au demonstrat implicarea ATM-urilor M1/​​M2 în reglarea sensibilității la insulină. Ștergerea genelor marker M1, cum ar fi TNF-α (15) și receptorul chemokinei cu motiv C-C (CCR) 2 (8) sau ablația celulelor CD11c pozitive a dus la normalizarea sensibilității la insulină (16). Pe de altă parte, șoarecii cu eliminarea specifică a macrofagelor de receptor activat de proliferatorul peroxizomului (PPAR) γ sau PPARβ/δ au prezentat rezistență la insulină cu număr redus și funcție afectată a macrofagelor M2 (17-20). Ultimele studii au indicat, de asemenea, că IL-4 sau IL-13 din adipocite sau hepatocite promovează expresia PPARγ și PPARβ/δ în monocite, rezultând diferențierea macrofagelor M2. Deși este în general acceptat faptul că ATM-urile M1 induc rezistența la insulină secretând o varietate de citokine proinflamatorii, modul în care contribuie ATM-urile M2 la ameliorarea rezistenței la insulină este necunoscut în prezent.

Recent, Lumeng și colab. (10) au folosit CD11c ca marker M1 într-o analiză de citometrie în flux și au raportat că obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi (HFD) determină o trecere a ATM-urilor de la o stare polarizată M2 la animalele slabe la o stare proinflamatorie M1. Cu toate acestea, mecanismul precis al modului în care raportul crescut al macrofagelor M1 este indus la șoarecii obezi induși de dietă nu este pe deplin înțeles (de exemplu, macrofagele M1 sunt recrutați recent din monocite circulante sau macrofagele M2 prezente în țesutul adipos slab se diferențiază în macrofage M1 ?)

Pentru a evalua mai precis modificările numărului, precum și expresia genică a markerilor M1 și M2, am analizat ATM-urile șoarecilor prin citometrie în flux folosind CD206 ca marker M2 pe lângă utilizarea CD11c ca marker M1. Aici, arătăm că ATM-urile M1 CD11c-pozitive/CD206-negative și ATM-urile M2 CD206-pozitive/CD11c-negative au constituit populații distincte. Numărul de macrofage M1 și raportul M1-la-M2 sunt legate de dezvoltarea rezistenței la insulină. Interesant este faptul că supraexprimarea IL-10 de către vectorul adenovirus a crescut markerii ATM-urilor M2 în țesutul adipos, sugerând că o expresie îmbunătățită a IL-10 printr-un tratament HFD și/sau pioglitazonă poate fi implicată într-un comutator fenotipic în ATM-uri.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Pioglitazona a fost oferită cu amabilitate de Takeda (Tokyo, Japonia). Un anticorp monoclonal de șobolan împotriva șoarecului F4/80, un anticorp monoclonal de șobolan împotriva șoarecelui CD11c, un anticorp CD206 de șobolan conjugat cu Alexa 647 și un anticorp MglI de șobolan conjugat cu Alexa 488 au fost achiziționați de la AbD-Serotec (Oxford, Marea Britanie). Un anticorp F4/80 de șobolan conjugat cu izotiocianat de fluoresceină și un anticorp de hamster CD11c conjugat cu ficoeritrin au fost cumpărate de la eBiosciences (San Diego, CA) și BD Biosciences (San Jose, CA), respectiv.

Întreținerea șoarecilor.

Șoareci masculi C57BL/6J de șase săptămâni au fost cumpărați de la CLEA Japonia (Meguro-Ku, Japonia). Șoarecii au fost menținuți într-un ciclu standard de lumină (12 h lumină/întuneric) și li s-a permis accesul gratuit la apă și alimente. Au fost hrăniți cu o dietă standard care conținea 10% calorii din grăsimi (Nosan Corporation, Yokohama, Japonia) sau un HFD conținând 60% grăsimi (Research Diets, New Brunswick, NJ) timp de 17 săptămâni. În ultimele 5 săptămâni ale intervenției dietetice, jumătate dintre șoarecii care au primit HFD au fost trecuți la HFD suplimentat cu pioglitazonă (10 mg · kg -1 -1 zi -1). Politicile și procedurile de îngrijire a animalelor pentru experimente au fost aprobate de comitetul de studii pe animale de la Universitatea din Toyama.

Infecția vectorului adenovirus.

Un ADNc care codifică IL-10 uman a fost inserat într-un vector de adenovirus folosind kitul de expresie pentru adenovirus (Ad-hIL-10) (Takara Bio, Shiga, Japonia) așa cum a fost descris anterior (21). Ad-X-DsRed2 (Ad-R2), un vector de adenovirus care codifică Discosoma sp. proteină fluorescentă roșie, a fost utilizată ca vector de control (Clontech, Mountain View, CA). Ad-hIL-10 sau Ad-R2 a fost injectat intraperitoneal.

Imunohistochimia macrofagelor din țesuturile adipoase albe.

Colorarea F4/80 a fost efectuată folosind un sistem de detectare a polimerilor de aminoacizi și un kit de colorare a șoarecilor Histofine (Nichirei, Tokyo, Japonia). Secțiunile au fost incubate cu anticorp anti-F4/80 (diluare, 1: 100) peste noapte la 4 ° C și au fost incubate cu un anticorp secundar de Histofine Simple Stain Max PO (șobolan) timp de 30 de minute. Pentru colorarea CD11c, secțiunile au fost incubate cu anticorpi CD11c de hamster anti-șoarece (diluare, 1:20) timp de 3 ore, apoi cu anticorp IgG anti-hamster de capră (diluare, 1: 100) timp de 1 oră și, în cele din urmă, cu Histofine Simple Pata Max PO (capră) timp de 30 min. Studiile de control negativ au fost, de asemenea, efectuate fără utilizarea acestor primii anticorpi. Toate secțiunile au fost contracolorate cu hematoxilină. Numărul total de celule și structura asemănătoare coroanei au fost numărate în 10 câmpuri diferite de mare putere din fiecare secțiune.

Izolarea adipocitelor și a fracțiilor stromal-vasculare.

Țesuturile adipoase epididimale de la șoareci au fost clătite în soluție salină, tocate în bucăți fine și digerate cu colagenază (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) cu tampon Krebs-Henseleit-HEPES, pH 7,4, suplimentat cu 20 mg/ml de BSA și 2 mmol/l glucoză la 37 ° C folosind un agitator timp de 45 min. Apoi, probele au fost trecute printr-o plasă și fracționate prin centrifugare scurtă (1.000 rpm). Peletele sau celulele plutitoare au fost colectate ca fracție stromal-vasculară (SVF) sau respectiv ca fracție adipocitară. Celulele din fiecare fracție au fost utilizate pentru extracția ARN sau analiza citometriei în flux.

Analiza citometriei de flux.

Celulele din SVF au fost incubate în Pharm Lyse (BD Biosciences) timp de 15 minute la 4 ° C și resuspendate în tamponul de colorare Pharmingen (BD Biosciences). Celulele au fost incubate cu 2.4G2 (BD Biosciences) timp de 10 min și apoi cu anticorpi primari sau cu izotipurile martor potrivite timp de 30 min la 4 ° C. Apoi, celulele au fost clătite de două ori și resuspendate în tamponul de colorare Pharmingen. După incubarea cu 7-amino-actinomicina D (BD Biosciences), celulele au fost analizate folosind un sortator de celule FACSAria (BD Biosciences). Analiza datelor a fost efectuată utilizând FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Macrofagele M1 sau M2 au fost identificate ca celule F4/80-pozitive/CD11c-pozitive/CD206-negative sau F4/80-pozitive/CD11c-negative/CD206-pozitive. Numărul de macrofage M1 sau M2 a fost calculat prin înmulțirea numărului de celule trypan albastre - negative cu raportul dintre celulele F4/80-pozitive/CD11c-pozitive/CD206-negative sau cel al F4/80-pozitive/CD11c-negative/Celule CD206-pozitive.

RT-PCR cantitativ.

ARN-ul total a fost extras din țesutul adipos epididimal sau celule sortate folosind kitul RNeasy (Qiagen, Hilden, Germania). ADNc a fost sintetizat cu transcriptază inversă multiscriptă (Applied Biosystems, Foster City, CA). RT-PCR cantitativă pentru fiecare genă a fost efectuată utilizând metoda TaqMan (50 ° C timp de 2 minute, 95 ° C timp de 10 minute și 40 de cicluri de 95 ° C timp de 15 secunde și 60 ° C timp de 1 minut) cu seturi de grunduri premade (Applied Biosystems). Abundența relativă a transcrierilor a fost normalizată în funcție de expresia ARNm 18S și a fost analizată folosind o metodă de curbă standard.