Schema pentru construirea vectorului de albumină serică umană în două copii (HSA) (regiunea roșie indică caseta de expresie HSA). Dimensiunile afișate nu sunt la scara reală.

text

(a) Analiza electroforezei pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) a proteinei extracelulare totale produse în condiții neoptimizate (Invitrogen standard), banda 1: scara de proteine. Supernatant de cultură (20 uL) din Clona # 52 (HSA cu o singură copie): Banda 2 și Clona # 14 (HSA cu două copii): Banda 3. Săgeata indică banda HSA. (b) Spectrul peptidic de desorbție/ionizare-timp-de-zbor (MALDI/TOF) asistat de matrice a benzii proteice din Clona # 14.

(a) Diagrama Pareto obținută din proiectul Plackett-Burman reprezentând ordinea și contribuția procentuală a fiecărui parametru la producția de HSA stabilă. Culoarea albastră și portocalie reprezintă contribuția negativă și respectiv pozitivă. (b) Efectele estimate ale variabilelor independente asupra producției de HSA de către Clona # 14. Roșu indică cel mai semnificativ, în timp ce albastru indică parametri nesemnificativi.

Grafice de suprafață de răspuns tridimensional și grafice de contur care indică efectul parametrilor individuali și interacțiunea dintre doi parametri. Efectul efectului combinat al temperaturii și metanolului (a), peptonei și temperaturii (b) și al metanolului și peptonei asupra producției de HSA (c). Corelația dintre răspunsul prezis și cel observat (Y ca HSA produs în mg/L) (d).

(a) Producția totală de proteine ​​extracelulare, ELISA, analiza densitometriei pe gel a HSA secretată în două copii ale Clonei nr. 10, 14 și în copia singură a Clonei # 52 în condiții de mediu optimizate (O) și neoptimizate (U). (b) Analiza SDS-PAGE a culturii filtrate din clonele menționate la litera (a). Lane1- Protein Ladder, Lanes 2, 4- Clone #s 10, 14, în condiții optimizate și Lanes 3, 5 pe mediu neoptimizat. Căile 6, 7 arată profilul proteic extracelular al Clonei # 52 în condiții optimizate și, respectiv, neoptimizate.

(a) Test de viabilitate celulară (MTT) cu linii celulare Vero. Variația de ori a proliferării a fost măsurată în absența oricărui ser fetal bovin (FBS) (▲), 5% FBS (■) sau 10% FBS (●), 5% FBS + 1 g/L HSA comercial (▼), 5 % FBS + HSA purificat 0,5 g/L (○) sau 5% FBS + HSA purificat 1 g/L ((). (b) Analiza SDS-PAGE a HSA purificată din Clona # 14 cultivată pe mediu optimizat. Banda 1: Marker, Banda 2: HSA comercială (4 µg), Banda 3: 4 µL fracție de cromatografie lichidă cu proteine ​​rapide (FPLC). (c) Semnificația statistică a diferenței a fost determinată de testul t asociat, luând 5% FBS ca referință standard pentru experimentele de proliferare celulară.

(a) Gene reglementate în metabolismul carbonului în condiții optimizate (b) Gene reglementate în metabolismul azotului conform căilor KEGG în condiții optimizate și neoptimizate. Intensitatea genelor în sus (prezentate în roșu) și în reglarea în jos (verde) este arătată de numărul de săgeți. O săgeată reprezintă schimbarea unității log2fold de 1.

(a) Gene reglementate în calea post-transcripțională în condiții optimizate și neoptimizate. (b) Gene reglementate în transportul proteinelor către ER, cale de pliere și secretorie în condiții optimizate și neoptimizate.

Analiza calitativă a reacției în lanț a polimerazei (QPCR) a unor gene (a) în sus și (b) reglementate în jos sub optimizare vs. condiții media neoptimizate. (c) Funcția biologică a genelor menționate la literele (a) și (b).

Abstract

1. Introducere

2. Materiale și metode

2.1. Materiale

2.2. Tulpini și construcția casetelor de expresie cu o singură și 2 copii ale HSA

2.3. Liniile celulare animale și trusa de testare a proliferării celulare

2.4. Cultivarea HSA recombinant care produce P. pastoris pe mediu neoptimizat și optimizat și optimizarea producției HSA prin metodologia suprafeței de răspuns

2.5. Test de purificare și proliferare celulară a HSA recombinant

2.6. Analiza transcriptomului

2.7. qPCR Validarea genelor țintă identificate

Diametru 4 mm. Detaliile despre prepararea ADNc și reacțiile qPCR sunt date în Anexa B. Gliceraldehida 3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) a fost utilizată ca genă de referință pentru menaj, cu X-33 ca gazdă martor. Diferența de pliere a nivelurilor de transcriere a fost calculată după cum urmează [29]:

2.8. Metode de analiză

3. Rezultate

3.1. Optimizarea codonilor HSA și producției native în P. pastoris

230 ± 35 mg/L) la nivel de 100 ml. Digestia cu tripsină a benzii la

Poziția de 66 kDa (Figura 2a) urmată de analiza MALDI-TOF a indicat prezența mai multor fragmente de peptide (Figura 2b). Acestea ar putea fi corelate cu peptidele teoretice așteptate după digestia cu tripsină a HSA intacte. Acest lucru a confirmat că proteina s-a rezolvat la

Poziția de 66 kDa în electroforeza pe gel de dodecilsulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) a fost cea a HSA.

3.2. Proiectare medie și evaluare a HSA secretat

290 mg/L (Run # 12) (Tabelul S1 din fișierul suplimentar). Utilizarea modelului cu regresie multiplă a permis o corelație între cei șapte factori și producția de HSA stabilă. Din rezultatele diagramei Pareto (Figura 3a) și efectele estimate (Figura 3b), s-a observat că temperatura, nivelul metanolului și concentrația peptonei în faza de inducție au avut efectul maxim asupra producției de HSA stabilă. Contribuția lor procentuală a fost de 40,

28, respectiv 25%, reprezentând 93% din efect. Analiza bazată pe analiza varianței (ANOVA, vezi Tabelul S4 din fișierul suplimentar) a indicat că valoarea p a modelului a fost 0,0022 (2) a fost 0,9990, ceea ce a arătat că 99,9% din variația valorii producției HSA ar putea fi demonstrată de către factori aleși în acest studiu. O valoare de precizie adecvată de 82,18 (care a fost >> 4) este considerată de dorit și indică faptul că modelul ar putea fi utilizat pentru explorarea spațiului de proiectare.