Abstract

fundal

Reprogramarea epigenetică la gametii de mamifere resetează semnele de metilare care reglează expresia monoalelică a genelor imprimate. La bărbați, aceasta implică ștergerea semnelor de metilare maternă și stabilirea metilării specifice paternei pentru a ghida în mod adecvat dezvoltarea normală. Nu se cunoaște gradul în care factorii exogeni influențează fidelitatea reprogramării metilării. Am găsit anterior o asociere între obezitatea paternă și metilarea ADN-ului modificat în sângele din cordonul ombilical, sugerând că starea endocrină, nutrițională sau a stilului de viață al tatălui ar putea potența anomalii epigenetice ereditare intergeneraționale. În aceste analize, examinăm relația dintre excesul de greutate masculin/obezitate și starea de metilare a ADN-ului regiunilor de reglare ale genelor imprimate în gameți.

Metode

Modele de regresie liniară au fost utilizate pentru a compara procentele de metilare a ADN-ului spermatozoizilor, cuantificate prin pirozecvențiere bisulfită, la 12 regiuni metilate diferențial (DMR) de la 23 de bărbați supraponderali/obezi și 44 de bărbați cu greutate normală. Populația noastră de studiu a inclus 69 de voluntari din studiul Influența mediului asupra reprogramării epigenetice gametice (TIEGER), cu sediul în NC, SUA.

Rezultate

După ajustarea pentru vârsta și starea de fertilitate a pacientului, materialul seminal de la bărbații supraponderali sau obezi a avut procente de metilare semnificativ mai mici la nivelul MEG3 (β = -1,99; SE = 0,84; p = 0,02), NDN (β = -1,10; SE = 0,47; p = 0,02), SNRPN (β = -0,65; SE = 0,27; p = 0,02) și SGCE/PEG10 (β = -2,5; SE = 1,01; p = 0,01) DMR. Datele noastre sugerează în continuare o ușoară creștere a metilării ADN-ului la MEG3-IG DMR (β = +1,22; SE = 0,59; p = 0,04) și H19 DMR (β = +1,37; SE = 0,62; p = 0,03) la sperma bărbaților supraponderali/obezi.

Concluzii

Datele noastre susțin că statutul de supraponderalitate/obezitate la bărbați este trasabil în epigenomul spermei. Sunt necesare cercetări suplimentare pentru a înțelege efectul unor astfel de modificări și punctul de origine al diferențelor de metilare a ADN-ului între bărbații slabi și supraponderali/obezi. Împreună cu rapoartele noastre anterioare privind obezitatea paternă și schimbările epigenetice la descendenți, studiile noastre au stabilit bazele pentru viitoarele studii care investighează aberațiile de metilare gametică masculină datorate factorilor de stil de viață paterni, cum ar fi obezitatea.

fundal

Corpul de cercetări care susține ipoteza că bolile cronice la adulți, cum ar fi diabetul de tip II, tulburările metabolice și obezitatea, au origini timpurii au crescut în câmpul emergent al originilor dezvoltării sănătății și bolilor (DOHaD) [1]. Având în vedere creșterea epidemiei de obezitate, rolul obezității parentale în influențarea dezvoltării descendenților a devenit de un interes deosebit [2, 3]. Relația dintre influențele materne legate de dietă și obezitate și rezultatul descendenților a fost observată în multe studii [4-6], dar au fost comparativ mai puține cercetări cu privire la rolul taților. Cu toate acestea, un consens în creștere este de acord că influența factorilor paterni, în special a obezității, asupra sănătății descendenților nu ar trebui trecută cu vederea [3, 7-9].

Lucrările noastre anterioare privind cohorta de studiu nou-născut epigenetic (NEST) au arătat că nou-născuții părinților obezi au un epigenom modificat sub formă de profiluri de metilare modificate la unele regiuni de reglare a genelor imprimate [24, 25]. Genele imprimate diferă de alte gene reglate epigenetic prin faptul că semnele lor epigenetice și tiparele de expresie sunt dependente de părinte de origine, iar aceste tipare sunt transferate cu fidelitate și consistență, rezultând o expresie monoalelică [26, 27]. Marcajele de amprentă rezistă reprogramării epigenetice globale care are loc după fertilizare, înainte de specificarea stratului de germeni, permițând efectiv descendenților să moștenească orice modificări ale acestor semne de metilare stabile de la părinți [7]. Astfel, genele imprimate sunt candidați ideali pentru a investiga contribuțiile paterne dobândite timpuriu la epigenomii descendenți.

Pentru a lega definitiv obezitatea paternă de modificările de metilare ale descendenților, astfel de modificări trebuie să se regăsească în sperma tatălui. Examinarea celulelor spermatozoide permite studierea posibilelor modificări în stabilirea epigenomului gamet mic înainte de orice influență și modulare din factorii materni și in uter mediu inconjurator. Studiile la animale au fugit deja pentru a lega anomaliile epigenetice și fenotipice ale descendenților de modificările epigenetice paterne corespunzătoare ale spermei. Wei și colab. au constatat că șoarecii masculi cu rezistență la insulină indusă și glucoză la jeun afectată aveau descendenți cu susceptibilitate crescută la diabet și modele modificate de metilare în insulele pancreatice care se potriveau cu metilarea modificată a spermei de la părinții lor [20].

La populațiile umane s-au făcut foarte puține cercetări care să lege obezitatea paternă de modificările epigenetice specifice ale spermei. Scopul acestui studiu a fost de a determina dacă există sau nu o relație între supraponderalitatea/starea obezității și profilurile de metilare în spermatozoizi la 12 regiuni imprimate. Genele noastre de interes includ gena 3 exprimată maternal (MEG3), gena 1/transcript specific mesodermului exprimat paternal (PEG1/CEL MAI BUN), factor de creștere asemănător insulinei 2IGF2), H19, proteina 10 legată de receptorul factorului de creștere (GRB10), neuronatinăNNAT), necdin (NDN), polipeptida N ribonucleoproteică nucleară mică (SNRPN), sarcoglican epsilon (SGCE)/gena 10 exprimată paternalPEG10), gena 3 exprimată paternalPEG3), și adenomul pleiomorf genei 1 (PLAGL1). Aceste gene imprimate sunt efecte de creștere, importante în creșterea embrionară și fetală timpurie și/sau reglarea creșterii tumorii.

Metode

Participanții la studiu și colectarea datelor

Colectarea specimenelor

Voluntarii au fost rugați să doneze material seminal, urină și probe de sânge. Li s-a cerut să se abțină de la ejaculare timp de cel puțin 3 zile, dar nu mai mult de 10 zile înainte de vizita lor. Sperma a fost colectată la fața locului prin masturbare fără utilizarea lubrifianților într-un recipient steril de colectare a polipropilenei (Cardinal Health, Dublin, OH). Manualul de laborator al Organizației Mondiale a Sănătății (OMS) pentru examinarea și prelucrarea semenului uman Ediția a 5-a a fost menționată pentru valori normale [28]. Semenul a fost analizat pentru parametrii clinici standard după lichefiere, nu mai târziu de 60 de minute de la colectare. După finalizarea acestor analize clinice ale spermatozoizilor, probele au fost supuse unei centrifugări în grad de ISolat în doi pași (Irvine Scientific) pentru a selecta o populație mobilă îmbogățită în morfologie normală. Acest gradient de silice coloidală, format dintr-un strat inferior de 90% și un strat superior de 50%, este preparat prin adăugarea secvențială a 1,5 ml din fiecare la un tub conic de polistiren de 15 ml. Proba de spermă a fost pipetată deasupra stratului superior și centrifugată la 200 ×g timp de 15 minute. Soluția de gradient a fost îndepărtată și sperma peletată congelată și depozitată la -80 ° C pentru analize ulterioare de metilare a ADN-ului.

Analiza metilării ADN-ului

Au fost examinate regiunile diferit metilate (DMR) asociate cu următoarele gene: Cele două DMR analizate pentru DLK1/MEG3 domeniul imprimat a constat din MEG3-IG DMR (4 site-uri CpG) și MEG3 DMR (8 site-uri CpG) (chr 14q32.2). Regiunea din amonte de IGF2 promotorii genelor imprimate au inclus trei dinucleotide CpG (chr 11p15.5). DMR pentru H19 a inclus patru site-uri CpG (chr 11p15.5). Au fost de asemenea testați următorii DMR promotori genici: GRB10 (6 site-uri CpG) (chr 7p12.2), NDN (6 site-uri CpG) (chr 15q11.2), NNAT (3 site-uri CpG) (chr 20q.11.2), PLAGL1 (6 site-uri CpG) (chr 6q24), SGCE/PEG10 (6 site-uri CpG) (chr 7q21.3), SNRPN (4 site-uri CpG) (chr 15q11.2), PEG1/MEST (4 site-uri CpG) (chr 7q21.3) și PEG3 (10 site-uri CpG) (chr 19q13.43) [29, 30].

ADN-ul genomic a fost extras din probe de spermă folosind reactivi Puregene (Qiagen; Valencia, CA). ADN-ul genomic (800 μg) a fost tratat cu bisulfit de sodiu folosind kitul de metilare ADN Zymo EZ (Zymo Research; Irvine, CA), transformând citozinele nemetilate în uracili. Citozina metilată este nealterată prin acest tratament. După tratamentul cu bisulfit, ADN-ul (

analize statistice

Variabilele au fost definite după cum urmează: vârsta (18-24, 25-29, 30-35), cel mai înalt grad de educație (liceu, unele facultăți/facultăți sau studii postuniversitare), starea civilă (singur, căsătorit/care trăiește cu partenerul, sau divorțat/văduv), copii tatălui (da sau nu), numărul de ore de exerciții intensive pe săptămână (mai puțin de 4 sau 4 ore sau mai mult), numărul de ore petrecute la televizor, așezat sau inactiv pe săptămână sau săptămână sau 4 ore sau mai mult), concentrația spermei (mai puțin de 1,5 × 107 sau 1,5 × 107 spermatozoizi/ml sau mai mult), motilitatea spermei (mai puțin de 40 sau 40% sau mai mult), numărul total de spermatozoizi sau TMC mai mare sau egal cu 3,9 × 10 7 sau mai mult de 3,9 × 10 7) și statutul pacientului în clinica de fertilitate (da sau nu). Testele Chi-pătrat au fost utilizate pentru a compara starea supraponderală/obezitate a participanților din cadrul diferitelor subgrupuri. Dacă numărul participanților a fost mic (2 ≤ IMC 2), supraponderal (25 kg/m 2 ≤ IMC 2) și obezi (IMC ≥ 30 kg/m 2). În scopul acestei analize, persoanele cu IMC peste 25 de ani au fost clasificate ca „supraponderale/obeze”.

Procentele medii de metilare a ADN la fiecare situs CpG și media pentru DMR general la bărbații cu greutate normală comparativ cu bărbații supraponderali/obezi au fost comparate utilizând un Mann-Whitney U Test. Aceste analize au fost extinse utilizând modele de regresie multivariată, ajustând factorii potențiali de confuzie. Potențialii confundanți au fost selectați pe baza asociațiilor cunoscute sau observate cu metilarea ADN-ului și cu obezitatea; în ultima analiză principală, am controlat vârsta și starea pacientului la clinica de fertilitate ca confundători. Analizele de sensibilitate folosind subgrupuri ale participanților noștri și diverse analize multivariate, cu și fără variabilele noastre, au fost repetate și comparate. Toate analizele s-au bazat pe datele de laborator disponibile pentru fiecare sit CpG la DMR. Analizele statistice au fost efectuate în SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, SUA).

Etică

Studiul TIEGER a fost realizat cu aprobarea Comitetului de revizuire instituțională a Universității Duke (număr de referință: Pro00036645). Consimțământul informat a fost obținut de la toți participanții pentru utilizarea specimenelor lor biologice și a datelor chestionarului.

Rezultate

Caracteristicile participanților la studiu

Distribuțiile caracteristicilor participanților la studiu pe categorii de IMC sunt prezentate în Tabelul 1. Douăzeci și trei de bărbați au fost clasificați ca supraponderali/obezi, reprezentând 33,3% din populația noastră de studiu. Mai precis, 11 bărbați erau supraponderali (25 ≤ IMC Tabelul 1 Date socio-demografice ale voluntarilor de sex masculin

Metilarea la gene imprimate în ADN-ul spermatozoizilor participanților TIEGER

Profilurile de metilare ale ADN-ului spermatozoizilor de la bărbați cu greutate normală sunt prezentate în tabelul 2. După cum s-a anticipat, următoarele DMR genice au fost aproape 100% metilate (interval, 80,0 până la 93,9%): MEG3-IG, H19, și IGF2, în concordanță cu originea paternă cunoscută a metilării pentru aceste regiuni. Alte DMR genice studiate au fost aproape complet nemetilate (interval, 1,6 până la 4,1% metilat), în concordanță cu originea maternă cunoscută a metilării pentru aceste regiuni și cu cerința ca aceste regiuni să fie demetilate în spermă înainte de concepție. O excepție a fost DMR pentru MEG3, care a fost nemetilat (aproximativ 0%) în spermatozoizi, în ciuda faptului că este cunoscut DMR paternal metilat. Cu toate acestea, se știe că acest DMR dobândește metilare post-fertilizare la șoarece [31]; astfel, acest model de metilare este încă în concordanță cu o origine paternă.

Nivelurile de metilare la genele imprimate la sperma bărbaților supraponderali/obezi comparativ cu bărbații cu greutate normală

Cel puțin două din cele 12 DMR studiate în spermatozoizi au fost metilate diferențial prin obezitate sau stare excesivă. Sperma bărbaților supraponderali sau obezi a avut un nivel semnificativ mai mare (2,8%) de metilare a ADN-ului decât sperma bărbaților cu greutate normală (p Tabelul 3 Analize multivariate: metilarea ADN-ului la DMR-urile genelor imprimate în celulele spermei ale voluntarilor obezi și supraponderali comparativ cu bărbații cu greutate normală

metilarea

Diferențe de metilare la spermă de la bărbații supraponderali/obezi față de bărbații cu greutate normală la gene imprimate. Diferențele în procentele de metilare între bărbații supraponderali/obezi și bărbații cu greutate normală sunt arătați de site-ul CpG pentru fiecare DMR studiat, ajustat în funcție de vârstă și starea pacientului la Duke Fertility Center. Baruri reprezintă SE

Pentru a evalua potențialul de prejudecată de selecție în funcție de vârstă, aceste analize au fost repetate, restrângând eșantionul studiului la 41 de bărbați cu vârsta cuprinsă între 25 și 35 de ani. Deși această reducere a dimensiunii eșantionului a scăzut precizia estimărilor noastre, constatările generale nu s-au modificat (datele nu sunt prezentate), sugerând că asocierea dintre supraponderalitate sau obezitate și metilarea ADN-ului în aceste regiuni nu este influențată în mod nejustificat de vârstă.

Discuţie

Pot fi implicate și alte expuneri, cum ar fi factorul BPA sau metaboliții săi care perturbă endocrin. Acești factori de mediu ar putea juca un rol în influențarea atât a creșterii în greutate, cât și a spermatogenezei și, prin urmare, nu se poate exclude complet faptul că atât creșterea IMC, cât și modificările de metilare sunt rezultate paralele ale expunerilor la mediu [45]. Studiile viitoare ar trebui să depună eforturi pentru a elucida mecanismele care stau la baza prin care supraponderalitatea/obezitatea pot afecta diferențele de metilare și dacă un al treilea factor, cum ar fi expunerea la mediu sau profilurile nutriționale, poate influența ambele rezultate.

Modificările de metilare pe care le-am găsit în acest studiu au fost subtile. Cu toate acestea, aceste mici modificări ale spermei pot avea în continuare un impact asupra fenotipurilor descendenților. Murphy și colab. a raportat că o modificare de 1% a metilării la IGF2 DMR duce la dublarea sau la înjumătățirea IGF2 transcriere, în funcție de direcția de metilare. Acest grad de schimbare este echivalent cu pierderea completă a amprentării, ceea ce este deosebit de semnificativ, deoarece această pierdere a amprentării este adesea observată în cazurile de cancer [46]. Modificările modeste de metilare ale spermei asociate cu obezitatea găsite aici sunt, de asemenea, în concordanță cu modificările de metilare induse la om de alte expuneri la viață timpurie și factori de stil de viață, inclusiv expunerea prenatală la foamete [47], suplimentarea nutriției materne [48], utilizarea medicamentelor în timpul sarcinii [49, 50] și expunerii materne la cadmiu [51] și plumb (în presă de Nye și Hoyo în Environmental Epigenetics). Schimbările mari ale metilării pot fi, de fapt, mai puțin semnificative în ceea ce privește impactul intergenerațional, deoarece aberațiile semnificative ale metilării nu pot duce la descendenți viabili.

Deși alții au făcut o analiză similară la populațiile mai mici [33], o posibilă slăbiciune a acestui studiu rămâne puterea statistică limitată de a detecta diferențe semnificative. Mai mult, o treime din populația noastră a fost recrutată la Duke Fertility Center. Deși ne-am ajustat în funcție de statutul pacientului în Centrul de Fertilitate, poate exista o confuzie reziduală rezultată din diferențele inerente în caracteristicile ADN-ului spermei între bărbații (obezi) cu potențiale probleme de fertilitate care frecventează clinica și cei care nu frecventează clinica. Prin urmare, rezultatele noastre privind diferențele epigenetice ale spermei pot reflecta parțial efectele la pacienții care solicită îngrijire la o clinică de fertilitate, mai degrabă decât la populația generală. În plus, ne-am concentrat doar pe bărbații caucazieni auto-raportați, în timp ce Carolina de Nord include, de asemenea, o populație substanțială din alte etnii sau origini, cu o prevalență mai mare a obezității, de exemplu, afro-americani [52]. Având în vedere prevalența crescândă a obezității la bărbați, descoperirile noastre provocatoare necesită replicarea într-un studiu multietnic mai mare.

Punctele forte ale studiului nostru includ faptul că populația noastră de studiu a fost formată din bărbați în vârstă de reproducere. În plus, nu am selectat sub niciun criteriu grupurile noastre obeze și non-obeze. Nu s-au făcut excluderi pe baza condițiilor de sănătate (altele decât cele legate de fertilitate), așa cum sa făcut în Donkin și colab. studiu [33]. Ne-am concentrat pe un grup de elemente de reglare care sunt stabilite în timpul spermatogenezei (sau post-fertilizare timpurie în cazul MEG3 DMR) și care sunt critice în programarea modelelor corecte de expresie a genelor imprimate. Deoarece genele imprimate sunt, în general, scutite de reprogramarea globală post-fertilizare, modelele de metilare stabilite în timpul spermatogenezei sunt persistente și, astfel, transferate descendenților.

Concluzii

Studiul actual s-a concentrat exclusiv pe programarea semnelor de amprentă în timpul gametogenezei masculine. Rezultatele noastre indică faptul că obezitatea sau factorii asociați acesteia pot schimba programarea epigenetică într-o mică parte a spermatozoizilor. Contribuția obezității paterne la dezvoltarea fetală și ulterioară a adulților este deosebit de relevantă datorită tendinței globale a obezității și merită o explorare ulterioară. Din fericire, studiile au indicat, de asemenea, că efectele paterne asupra descendenților viitori pot fi prevenite prin pierderea în greutate și exercițiile fizice [53]. Epigenetica poate furniza cheia influențelor intergeneraționale ale obezității și a altor factori de stil de viață, atât ai mamelor, cât și ai taților, asupra sănătății descendenților. Dacă obezitatea paternă are de fapt un efect asupra sănătății și dezvoltării ulterioare a descendenților, atunci nevoia de schimbare a stilului de viață este și mai urgentă.