Abstract

OBIECTIV Obezitatea se caracterizează prin stres oxidativ cronic. Factorul de creștere a fibroblastelor 21 (FGF21) a fost identificat recent ca un hormon nou care reglează metabolismul. Factorul 2 legat de NFE2 (Nrf2) este un factor de transcripție care orchestrează expresia unei baterii de gene antioxidante și de detoxifiere atât în ​​condiții bazale, cât și în condiții de stres. Studiul actual a investigat rolul Nrf2 într-un model de șoarece de obezitate indusă de o dietă bogată în grăsimi pe termen lung (HFD) și a caracterizat asocierea acestuia cu FGF21 în acest proces.

reprimă

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII Șoarecii de tip sălbatic (WT) și Nrf2 knockout (Nrf2-KO) au fost hrăniți cu HFD timp de 180 de zile. În această perioadă, au fost măsurate consumul de alimente și greutățile corporale. Metabolismul glucozei a fost evaluat printr-un test de toleranță la glucoză intraperitoneală și un test de toleranță la insulină intraperitoneal. ARN-ul total a fost preparat din ficat și țesut adipos și a fost utilizat pentru RT-PCR cantitativă în timp real. Plasma de post a fost colectată și analizată pentru chimie a sângelui. Linia celulară ST-2 a fost utilizată pentru studii de transfecție.

REZULTATE Șoarecii Nrf2-KO au fost parțial protejați de obezitatea indusă de HFD și au dezvoltat un fenotip mai puțin rezistent la insulină. Important, șoarecii Nrf2-KO au avut niveluri plasmatice mai ridicate de FGF21 și niveluri mai ridicate de ARNm FGF21 în ficat și țesut adipos alb decât șoarecii WT. Astfel, fenotipul metabolic modificat al șoarecilor Nrf2-KO sub HFD a fost asociat cu o expresie și o abundență mai mari de FGF21. În mod consecvent, supraexprimarea Nrf2 în celulele ST-2 a dus la scăderea nivelurilor de ARNm FGF21, precum și la activitatea suprimată a unui reporter al luciferazei promotor FGF21.

CONCLUZII Identificarea Nrf2 ca un regulator nou al FGF21 extinde înțelegerea noastră a diafragmei dintre metabolism și apărarea stresului.

Factorul de creștere a fibroblastelor 21 (FGF21) aparține familiei de FGF atipice care nu au domeniul convențional de legare a heparinei (1,2) și se pot difuza astfel de țesuturile lor de origine pentru a funcționa ca hormoni. FGF21 este exprimat abundent în ficat, pancreas și țesut adipos alb (WAT) (3,4). Semnalizează prin complexe de suprafață celulară ale receptorilor FGF cu proteina transmembranară β-Klotho (5-8). Spre deosebire de receptorii FGF larg exprimați, β-Klotho este exprimat într-un set limitat de țesuturi care includ ficatul, WAT, pancreasul și testiculele, direcționând astfel probabil activitatea FGF21 către aceste organe țintă (8,9).

Studiile farmacologice au arătat că FGF21 are acțiuni metabolice largi la rozătoarele obeze și primatele (rev. În 10). Șoarecii transgenici care supraexprimă FGF21 în ficat au îmbunătățit sensibilitatea la insulină și clearance-ul glucozei și au redus concentrațiile plasmatice de trigliceride și au fost rezistenți la creșterea în greutate atunci când au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) (11). Efecte similare au fost observate la șoarecii ob/ob sau db/db rezistenți la insulină sau la șobolanii grași diabetici Zucker după administrarea FGF21 recombinant (11,12). Administrarea de FGF21 la șoareci obezi induși de HFD a crescut utilizarea grăsimilor și consumul de energie și a redus concentrațiile plasmatice de glucoză, insulină și lipide, precum și concentrațiile hepatice de trigliceride (11-13). FGF21 a îmbunătățit, de asemenea, sensibilitatea la insulină hepatică și periferică atât la șoarecii obezi slabi, cât și la cei obezi induși de HFD (12). La maimuțele rhesus diabetice, FGF21 a cauzat scăderi semnificative ale glicemiei, insulinei și trigliceridelor plasmatice, în timp ce scade, de asemenea, colesterolul LDL, crește colesterolul HDL și provoacă o pierdere modestă în greutate (14).

Datorită efectelor sale benefice asupra metabolismului glucidic și lipidic, FGF21 este un candidat pentru tratamentul diabetului de tip 2 și a sindromului metabolic (10,15). Cu toate acestea, nu se știe suficient despre reglarea FGF21 endogen în bolile metabolice. Elucidarea factorilor care controlează expresia și activitatea FGF21 în stările slabe și obeze ar putea duce la noi strategii terapeutice.

Factorul de transcriere a vertebratelor NFE2 factor 2 legat de NFE2 (Nrf2) este un membru al familiei cap’n’collar care a apărut ca un regulator principal al stării redox și a răspunsurilor de detoxifiere a celulei (16-19). Sistemul Nrf2 mediază atât reglarea capacității antioxidante de bază, cât și răspunsul la stres în timpul provocărilor oxidative acute. La șoareci și celule cultivate la om, zeci de gene protectoare sunt induse ca răspuns la provocările chimice oxidative și electrofile într-un mod dependent de Nrf2 (rev. În 20). Nrf2 activat prin stres reglează în sus transcrierea genelor sale țintă prin legarea la secvențele de elemente de răspuns antioxidante din promotorii lor înrudiți (21). În plus față de genele sale țintă antioxidante și de detoxifiere omniprezente, Nrf2 are și grupuri de ținte specifice țesuturilor. În ficat, majoritatea acestor gene codifică proteine ​​specifice sintezei și metabolismului acizilor grași și altor lipide (22,23). Interesant este faptul că aceste gene metabolice sunt în primul rând reprimate - mai degrabă decât induse - de Nrf2 prin mecanisme necunoscute.

Având în vedere rolul Nrf2 ca regulator al homeostaziei lipidelor, manipularea farmacologică a acesteia ar putea fi benefică în tratarea tulburărilor metabolice, cum ar fi dislipidemia și obezitatea. Într-adevăr, activarea Nrf2 de către triterpenoidul sintetic CDDO-Im la șoareci WT a împiedicat creșterea masei țesutului adipos, a greutății corporale și a nivelului seric al trigliceridelor, precum și a ficatului gras cauzat de un HFD; această protecție împotriva obezității a fost abolită la animalele Nrf2-KO (23). Mai mult, s-a demonstrat că statinele activează Nrf2 atât în ​​cultura celulară, cât și in vivo (28,29), ceea ce poate explica unele dintre efectele lor antioxidante (30). Este important să se elucideze în continuare mecanismele prin care Nrf2 reglează metabolismul și să se identifice sistemele de control metabolic cu care interacționează. Studiul actual a investigat rolul Nrf2 în timpul unui HFD pe termen lung (180 de zile) și a identificat Nrf2 ca un nou regulator al FGF21 în timpul obezității induse de HFD.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

C57BL6 J Nrf2 +/− șoareci, dezvoltat inițial de Prof. M. Yamamoto (31), au fost obținute de la RIKEN BRC (Tsukuba, Japonia). Șoarecii WT și Nrf2-KO au fost generați prin împerecherea șoarecilor masculi și femele Nrf2 +/−; descendenții au fost genotipați așa cum s-a descris anterior (31). Șoarecii masculi WT și Nrf2-KO (în vârstă de 9-10 săptămâni) au fost hrăniți cu o dietă standard (SD) (10 kcal% grăsime) sau cu HFD (60 kcal% grăsime; Research Diets, New Brunswick, NJ) timp de 180 de zile. Șoarecii au fost găzduiți în instalația pentru animale a Facultății de Medicină a Universității din Patras, în camere controlate de temperatură, lumină și umiditate, cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Toate procedurile la animale au fost aprobate de comisia de revizuire instituțională a Școlii de Medicină a Universității din Patras și au fost în conformitate cu Directiva Comisiei Europene 86/609/CEE.

Evaluarea sensibilității la insulină.

Glicemia a fost măsurată folosind un glucometru Precision Xceed (Abbott, Chicago, IL) în sângele colectat din coada șoarecelui. Pentru a evalua toleranța la glucoză, o doză unică de d-glucoză (100 mg/ml în apă, 10 ml/kg) a fost injectată intraperitoneal după 18 ore de post cu acces liber la apă. Pentru a evalua toleranța la insulină, o doză unică de insulină Actrapid obișnuită (Novo Nordisk, Copenhaga, Danemarca) (0,75 unități/kg) a fost injectată intraperitoneal după 4 ore de post cu acces gratuit la apă.

Măsurători ale hormonilor și metaboliților.

Plasma a fost colectată folosind heparină ca anticoagulant și a fost centrifugată la 2.000 g timp de 20 minute la 4 ° C. Măsurătorile plasmatice au fost efectuate în conformitate cu instrucțiunile producătorului pentru fiecare test. Testele imunosorbente legate de enzime au fost utilizate pentru leptina plasmatică (ALPCO, Salem, NH), insulina (ALPCO) și FGF21 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Acizii grași neesterificați (NEFA) au fost măsurați folosind kitul NEFA C (Wako Chemicals, Osaka, Japonia), iar β-hidroxibutiratul a fost măsurat folosind kitul de testare β-hidroxibutirat (corp cetonic) (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Glucoza, colesterolul, colesterolul HDL și trigliceridele au fost măsurate cu ajutorul unui analizor Olympus AU640 (Hamburg, Germania).

Studii de cultură celulară.

Cuantificarea nivelurilor de expresie genică.

Ficatul și WAT au fost scufundate imediat după colectare în soluția ulterioară de ARN (Ambion, Foster City, CA). ARN-ul total a fost izolat utilizând reactivul TRIzol (Invitrogen) și purificat în continuare folosind mini-kitul RNeasy (Qiagen, Hilden, Germania). A fost inclusă o etapă de digestie DNAse (TurboDNAse; Ambion) pentru a preveni contaminarea ADN genomic. ADNc-ul a fost sintetizat folosind sistemul de sinteză Superscript pentru prima șir (Invitrogen), iar PCR-urile în timp real au fost efectuate în triplicat pe un instrument Step One Plus (Applied Biosystems, Foster City, CA) folosind teste TaqMan Gene Expression on demand (Applied Biosystems) Stk #: FGF21, Mm00840165_g1; PGC-1α, Mm00447183_m1; PEPCK, Mm00440636; PPARα, Mm00440939_m1; GAPDH, 4352339E. Nivelurile relative de mARN au fost calculate prin metoda comparativă a ciclului de prag folosind GAPDH (gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază) ca genă de menaj. Nivelurile relative de expresie a ARNm Nrf2 au fost determinate de SYBR Green (Applied Biosystems) RT-PCR și calculate prin metoda curbei standard relative utilizând proteina de legare TATA (TBP) ca genă de menaj cu primeri descriși anterior (34).

analize statistice.

Șoarecii Nrf2-KO de pe HFD sunt mai puțin rezistenți la insulină decât șoarecii WT. Sunt prezentate rezultatele testelor de toleranță la glucoză și insulină la șoarecii WT și Nrf2-KO hrăniți cu HFD. Testele au fost efectuate la momentul inițial (A, B) și după 30 (C și D) și 180 (E și F) zile pe un HFD. Datele sunt mijloace ± SEM. n = 8 pentru fiecare genotip. * P s nivele (P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Parametrii metabolici plasmatici ai șoarecilor WT și Nrf2-KO alimentați cu SD sau HFD timp de 180 de zile