A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Hitoshi Watanabe, Tatsuya Nakano, Ryo Saito

obezitatea

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Hitoshi Watanabe, Tatsuya Nakano, Ryo Saito

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala universitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Hitoshi Watanabe, Tatsuya Nakano, Ryo Saito

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laboratorul de afiliere pentru științe alimentare și biomoleculare, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laborator de afiliere pentru științe alimentare și biomoleculare, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laboratorul de afiliere pentru chimia produselor animale, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laboratorul de afiliere pentru nutriție, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Afiliere Știința animalelor, Departamentul de producție biologică, Universitatea de Agricultură și Tehnologie din Tokyo, Fuchu-shi, Tokyo, 183–8509, Japonia

Departamentul de afiliere of Advanced Medicine and Development, BML Inc., Saitama, 350-1101, Japonia

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Institutul de Afiliere pentru Științe Biologice, de Mediu și Rural, Universitatea Aberystwyth, Cardiganshire, SY23 3DA, Regatul Unit

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

Laborator de biologie a pivniței de afiliere, Școala postuniversitară de științe agricole, Universitatea Tohoku, 1–1 Tsutsumidori Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, 981–8555, Japonia

  • Hitoshi Watanabe,
  • Tatsuya Nakano,
  • Ryo Saito,
  • Daisuke Akasaka,
  • Kazuki Saito,
  • Hideki Ogasawara,
  • Takeshi Minashima,
  • Kohtaro Miyazawa,
  • Takashi Kanaya,
  • Ikuro Takakura

Cifre

Abstract

Citare: Watanabe H, Nakano T, Saito R, Akasaka D, Saito K, Ogasawara H, și colab. (2016) Serotonina îmbunătățește obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi la șoareci. PLOS ONE 11 (1): e0147143. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0147143

Editor: Julie A. Chowen, Hosptial Infantil Universitario Niño Jesús, CIBEROBN, SPANIA

Primit: 2 septembrie 2015; Admis: 29 decembrie 2015; Publicat: 14 ianuarie 2016

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se găsesc în lucrare.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de un grant pentru proiectul de cercetare privind dezvoltarea produselor agricole și a alimentelor cu beneficii de promovare a sănătății (NARO) de la Ministerul Agriculturii, Silviculturii și Pescuitului și de Research Fellowship (23.7413) pentru Programul Tinerilor Oameni de Știință din Japonia pentru Promovarea științei (JSPS). Co-autorul Kohji Tahara este angajat de BML Inc. BML Inc. a oferit asistență sub formă de salariu pentru autorul KT, dar nu a avut niciun rol suplimentar în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. Rolul specific al acestui autor este articulat în secțiunea „contribuțiile autorului”.

Interese concurente: Autorii au următoarele interese: Co-autorul Kohji Tahara este angajat de BML Inc. Nu există brevete, produse în curs de dezvoltare sau produse comercializate de declarat. Acest lucru nu modifică aderarea autorilor la toate politicile PLOS ONE privind schimbul de date și materiale.

Introducere

Serotonina (5-HT) este un neurotransmițător monoaminergic cu activități care modulează funcțiile centrale și periferice. Primul pas în sinteza 5-HT din triptofan depinde de enzima triptofan hidroxilază (TPH), care este, de asemenea, enzima care limitează rata în biosinteza sa. Se știe că TPH posedă două izoforme, TPH1 și TPH2 [1]. TPH1 este prezent în cea mai mare parte în glanda pineală, splină, timus și celulele enterocromafine intestinale. TPH2 este exprimat în întregime în celulele neuronale, cum ar fi în nucleii de rafe ai trunchiului cerebral. 5-HT periferic la șoarecii knockout TPH1 nu poate fi înlocuit cu 5-HT sintetizat de TPH2 în sistemul nervos central [2]. Mai mult, se crede că 5-HT în periferie nu poate trece bariera hematoencefalică [3, 4]. Astfel, există două sisteme independente de organizare pentru 5HT: unul în sistemul nervos central și celălalt în periferie. 5-HT afectează comportamentul de hrănire și obezitatea în sistemul nervos central și aproape 2% din 5-HT al corpului este stocat acolo [5-10]. Pe de altă parte, 5-HT periferic nu a făcut obiectul unui studiu atât de intens, în special în ceea ce privește metabolismul grăsimilor și lipidelor corporale, chiar dacă aproximativ 98% din 5-HT din corp există în periferie.

Mușchiul scheletic are roluri importante în metabolismul energetic și în utilizarea glucozei, în special în timpul accizelor. Existența izoformelor cu lanț greu de miozină de tip lent și rapid se observă în fibrele musculare mature normale. Fibrele musculare de tip lent au o concentrație mare de mitocondrii și produc energie prin metabolism oxidativ. În contrast, fibrele musculare de tip rapid folosesc glicoliza ca sursă principală de ATP [18, 19]. Receptorul activat cu proliferator de peroxisom (PPAR) γ coactivator 1 a (PGC-1a), este identificat ca un coactivator al receptorului nuclear al PPARγ și este un regulator fiziologic principal pentru specificația fibrelor musculare de tip lent [19-21]. Șoarecii knock-out PGC-1α specifici mușchilor scheletici au afectat semnificativ toleranța la glucoză [22], în timp ce oamenii obezi au un procent semnificativ mai scăzut de fibre musculare de tip lent decât oamenii cu adipozități mai mici [23].

Se sugerează cu tărie că 5-HT poate fi un factor cheie în ceea ce privește metabolismul energetic în mușchiul scheletic, întrucât un studiu recent arată că un agonist 5HTR2 induce creșterea activității promotorului PGC-1α [24]. Pentru a verifica aceste ipoteze, am investigat efectul tratamentului pe termen lung al șoarecilor cu 5-HT periferic asupra obezității și metabolismului energetic în mușchii scheletici la șoareci pe dieta bogată în grăsimi.

Materiale și metode

Studii pe animale

Șoarecii masculi C57BL/6 au fost cumpărați de la Japan SLC (Shizuoka, Japonia). Toți șoarecii au fost găzduiți într-o instalație cu temperatură controlată (23 ° C) cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore și au fost hrăniți cu o dietă chow (14,4 MJ/kg) conținând 4,8% grăsimi (Ch) sau o dietă bogată în grăsimi (17,0 MJ/kg) conținând 13,6% grăsimi (F) (CLEA Japan, Inc., Tokyo, Japonia). Șoarecii au fost injectați i.p. cu serotonină (5-HT) (0,1 mg, 0,5 mg sau 1 mg) (Sigma, St. Louis, MO) sau soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) de două ori pe săptămână între vârstele de 5 și 26 de săptămâni. Greutatea corporală a șoarecilor a fost măsurată în același timp cu administrarea injecțiilor. Șoarecii au fost posti cu 12 ore înainte ca probele de sânge și țesuturi să fie recoltate în toate experimentele. Aportul alimentar din fiecare grup de șoareci a fost măsurat timp de 5 zile când aveau vârsta de 17 săptămâni. Temperatura rectală a fost măsurată cu un termometru (BAT-7001H; Physitemp Instruments Inc, Clifton, NJ) la vârsta de 26 de săptămâni. Experimentele au fost permise de Comitetul de Mediu și Siguranță al Universității Tohoku și au fost efectuate în conformitate cu Ghidul pentru experimentarea animalelor de la Universitatea Tohoku, care au fost sancționate de comitetul competent al Guvernului Japoniei.

Procentul de grăsime corporală și grăsime intraabdominală

Proporția de grăsime din întregul corp a fost determinată de metoda lui Folch. Toată grăsimea intraabdominală a fost îndepărtată din corp și cântărită. Proporțiile corpului total și a grăsimii intra-abdominale au fost normalizate în funcție de greutatea corporală.

Histologia țesuturilor adipoase albe

Țesuturile adipoase albe intra-abdominale au fost obținute de la șoareci la vârsta de 26 de săptămâni. Aceste țesuturi au fost fixate în 4% paraformaldehidă/PBS, (pH 7,2) și apoi încorporate în parafină. Colorarea cu hematoxilin-eozină a țesuturilor adipoase albe intraabdominale a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [13]. Mărimile adipocitelor albe intraabdominale au fost determinate prin măsurarea a două sute de celule pe probă (n = 5).

Analiza chimiei plasmei

Probele de sânge au fost colectate de la șoareci în vârstă de 26 de săptămâni (n = 7-12) în tuburi răcite cu gheață conținând heparină (10 unități/tub) (Mochida, Tokyo, Japonia) și imediat centrifugate la 20.000 g timp de 15 minute. Probele de plasmă au fost depozitate la -80 ° C până la analiză. Toate concentrațiile plasmatice de hormoni și metaboliți au fost măsurate prin kituri disponibile comercial furnizate de Wako (Osaka, Japonia), altele decât cele pentru leptină și adiponectină, care au fost furnizate de sistemele de cercetare și dezvoltare (Minneapolis, MN). Toate procedurile au fost efectuate conform recomandărilor producătorului.

Teste de toleranță la glucoză și insulină

Un i.p. testul de toleranță la glucoză a fost efectuat la șoareci de 23 de săptămâni (n = 6). Glucoza (Sigma) a fost administrată i.p. la o doză de 2 mg/g greutate corporală. Un i.p. testul de toleranță la insulină a fost efectuat la șoareci de 25 de săptămâni (n = 6). Insulina (Sigma) a fost administrată i.p. la o doză de 0,225 U/kg greutate corporală. Probele de sânge au fost colectate din vena caudală a fiecărui șoarece la 0, 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după tratament. Concentrațiile plasmatice de glucoză și insulină au fost măsurate folosind metodele menționate mai sus.

Calorimetre indirecte

Metabolismul energetic al întregului corp a fost examinat folosind un calorimetru indirect cu circuit deschis (Arco-2000; Arco System, Chiba, Japonia). După ce sistemul a fost calibrat cu amestecuri standard de gaze, șoarecii au fost plasați în camere individuale de calorimetru acrilic cu acces gratuit la alimente și apă. Cheltuielile cu energia, definite ca consum de oxigen (VO2) și producția de dioxid de carbon (VCO2) au fost măsurate pe o perioadă de 24 de ore de la 16:00 la temperatura camerei. Timpul de aclimatizare a fost de 1 oră. Măsurătorile au fost normalizate în funcție de greutatea corporală.

Analiza imunohistochimică

Mușchii Gastrocnemius și soleus obținuți de la șoareci de 14 săptămâni au fost înghețați în acetonă răcită de gheață uscată. Pentru a determina tipul de fibre musculare scheletice, criosecțiile au fost tăiate folosind un microtom criostatic (Leica, Wetzlar, Germania) și supuse imunohistochimiei. Secțiunile au fost imunomarcate cu anticorpi monoclonali cu lanț greu de miozină anti-lentă (clona M 8421, 1: 600, Sigma) și anti-rapidă (clona M 4276, 1: 300, Sigma), markeri specifici de tip I și tip II myofibers, respectiv. Histofina Simplestain MAX-PO (M) (Nichirei, Tokyo, Japonia) a fost utilizată ca anticorp secundar. Proporția fiecărui tip de fibră a fost determinată în fiecare secțiune a mușchilor gastrocnemius și soleus utilizând o fotografie cu microscop (Keyence) și software-ul Scion Image.

Colorare NADH-tetrazolium reductază (NADH-TR)

Secțiunile proaspăt congelate ale mușchilor soleus și gastrocnemius la șoareci la vârsta de 14 săptămâni din fiecare grup au fost incubate în tampon Tris 0,05 M (pH 7,2) conținând NADH (Kohjin Co., Ltd., Tokyo, Japonia) și nitoroblue tetorazolium (NBT) (Nacalai Tesque, Inc, Kyoto, Japonia) timp de 30 de minute la 37 ° C. Colorarea a fost apoi curățată cu acetonă 50% și conservată cu mediu de montare apos.

Analiza raportului NAD +/NADH

Muschii Soleus și gastrocnemius au fost obținuți de la șoareci vechi de 14 săptămâni din fiecare grup. Aproximativ 5 mg din fiecare mușchi au fost folosite pentru analiza raportului NAD +/NADH. Concentrațiile de NAD + și NADH au fost măsurate folosind un kit de cuantificare NAD +/NADH (BioVision, San Francisco, CA). Procedura a fost efectuată conform instrucțiunilor producătorului.

analiza expresiei ARNm

ARN total a fost extras din probe de țesut înghețat folosind reactiv Trizol (Invitrogen, Co., Carlsbad, CA). ADNc a fost sintetizat din ARN-ul total cu trusa de transcripție inversă Superscript III (Invitrogen, Co., Carlsbad, CA) folosind primerii aleatori. Măsurarea în timp real a PCR a ADNc-urilor individuale a fost efectuată utilizând sistemul unic în timp real pentru ciclul termic de zaruri (Takara Bio Inc., Siga, Japonia). După incubare timp de 10 sec la 95 ° C, ADNc a fost urmat de PCR timp de 40 de cicluri (95 ° C, 5 sec: 60 ° C, 30 sec). Fluorescența verde SYBR a fost detectată la sfârșitul fiecărui ciclu pentru a monitoriza cantitatea de produs PCR format în timpul ciclului respectiv. La sfârșitul fiecărei runde, profilurile curbei de topire au fost înregistrate. Curba standard a fiecărui produs a urmat calculul expresiilor genei respective. Valorile au fost normalizate la cele ale ARN ribozomal 18S. Secvențele de exemplu sunt listate în Tabelul 1.

Efectul antagoniștilor receptorilor serotoninei

Ketanserina (Sigma), un antagonist pentru 5HTR2A, a fost dizolvată în HCI 0,1 M, diluată cu PBS și administrată într-un volum de dozare de 0,1 mg/șoarece. SB-204741 (Tocris Bioscience, Bristol, Marea Britanie), un antagonist pentru 5HTR2B, a fost dizolvat în DMSO, diluat cu PBS astfel încât concentrația finală de DMSO a fost de 0,1% și administrată într-un volum de dozare de 0,08 mg/șoarece. SB-269970 (Sigma), un antagonist 5HTR7 și metisergidă (Sigma), un antagonist 5HTR1, 2 și 7, au fost dizolvate în PBS și administrate într-un volum de dozare de 0,6 și respectiv 0,1 mg/șoarece. Toți antagoniștii erau i.p. injectat la 30 min înainte de injectarea 1 mg 5-HT. După 120 de minute, probele au fost colectate din mușchiul scheletic.

analize statistice

Valorile sunt raportate ca medii ± SE. Analizele statistice au fost efectuate utilizând testul t Student sau ANOVA unidirecțional și bidirecțional urmat de testul lui Tukey pentru a evalua diferențele statistice între grupuri. Valorile P mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative statistic.