Subiecte

Abstract

Proteina de control a catabolitului A (CcpA) este un regulator principal conservat, care utilizează sursa de carbon în bacteriile gram-pozitive, dar regulonul CcpA rămâne prost definit. În acest studiu ne-am propus să clarificăm regulonul CcpA prin determinarea impactului inactivării CcpA asupra virulenței și transcriptomului a trei serotipuri distincte ale principalului patogen uman Grup A streptococ (GAZ). Inactivarea CcpA a scăzut semnificativ virulența GAS într-o gamă largă de modele de provocare animală, în concordanță cu ideea că CcpA este esențială pentru patogeneza bacteriană gram-pozitivă. Prin transcriptomică comparativă, am stabilit că regulonul central al GAS CcpA este îmbogățit pentru motive de legare CcpA foarte conservate (adică. cre site-uri). Dimpotrivă, diferențele specifice tulpinii în transcriptomul CcpA par să constea în principal din rețele secundare afectate. Rafinarea cre compoziția site-ului prin analiza regulonului de bază a facilitat dezvoltarea unui modificat cre consens care arată promisiune pentru o predicție îmbunătățită a țintelor CcpA la alți agenți patogeni gram-pozitivi relevanți din punct de vedere medical.

Introducere

Mai multe studii au demonstrat o legătură între CcpA și virulența agenților patogeni gram-pozitivi majori, cum ar fi Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Staphylococccus aureus, Clostridium difficile, Bacillus anthracis și Enterococcus faecium 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Având în vedere povara imensă a infecțiilor bacteriene gram-pozitive, CcpA este una dintre cele mai influente proteine ​​reglatoare care modulează peisajul de virulență al bacteriilor patogene 26. În ciuda faptului că a fost investigat extensiv de peste 20 de ani, rămân numeroase lacune de cunoștințe critice în ceea ce privește funcția CcpA și impactul acesteia asupra patogeniei bacteriene. De exemplu, deși se știe că CcpA afectează expresia lui

15% din genomii a numeroase specii bacteriene, contribuția directă vs. efectele indirecte mediate de CcpA asupra transcrierii rămân neclare 15,27. În mod similar, rolul CcpA în virulența bacteriană gram-pozitivă a fost studiat în principal în modele de bacteremie, care reprezintă doar o fracțiune din tipurile de infecții pe care bacteriile care conțin CcpA le provoacă 28. Sunt necesare informații suplimentare cu privire la contribuția CcpA la patogeneza bacteriană gram-pozitivă, având în vedere rolul potențial al axei CcpA- (HPr-Ser46-P) -HPrK/P ca țintă antimicrobiană nouă 29 .

Majoritatea cunoștințelor referitoare la efectele mediate de CcpA asupra expresiei genetice s-au produs în avirulent Bacillus subtilis care este în legătură îndepărtată cu majoritatea organismelor în care s-a stabilit un rol pentru CcpA în patogenie 16,21,30,31. În schimb, grupa A. streptococ (GAS) cauzează o gamă largă de infecții la om pentru care sunt stabilite modele animale 32, este redusă mai puțin virulentă prin inactivarea CcpA și este strâns legată de alte organisme a căror infectivitate este afectată de ștergerea CcpA, cum ar fi S. pneumoniae și Streptococcus suis 15.18. Astfel, GAS poate fi utilizat pentru a evalua natura impactului de reglementare al CcpA asupra infectivității agenților patogeni gram-pozitivi. Am stabilit anterior că inactivarea CcpA într-o tulpină serotip M1 GAS afectează expresia

15% din genom și reduce letalitatea într-un model de infecție cu bacteremie. Există> 140 de serotipuri M distincte de GAS și inactivarea unei proteine ​​reglatoare poate avea efecte dramatic diferite în funcție de serotipul GAS studiat 33,34. Astfel, am căutat să studiem inactivarea CcpA în serotipuri multiple GAS pentru a testa ipotezele că efectul inactivării CcpA asupra virulenței GAS nu este dependent de serotip și că transcriptomica comparativă a tulpinilor GAS lipsite de CcpA ar facilita identificarea nucleului GC CcpA regulon.

Rezultate si discutii

CcpA ștergerea are efecte specifice serotipului

Pentru a îmbunătăți înțelegerea contribuției CcpA la fiziopatologia largă a infecțiilor cu GAS, am căutat să analizăm funcția CcpA la tulpinile de serotip M care sunt principalele cauze ale infecțiilor cu GAS și care sunt legate la distanță pe baza filogeniei genomului întreg (Fig. 1a) 35, 36,37,38. De asemenea, am folosit tulpini parentale care sunt complet secvențiate și se știe că nu au mutații în sistemul de control al virulenței (CovRS) cu două componente care afectează transcriptomul CcpA deoarece CovR și CcpA co-reglează numeroase gene GAS 39. Astfel, am ales tulpinile MGAS2221 (M1), MGAS10870 (M3) și MGAS6180 (M28) pentru studiul nostru 36,37,38. Secvența proteinei CcpA din aceste trei tulpini este identică (datele nu sunt prezentate). Inactivarea CcpA în aceste trei medii a dus la un defect de creștere substanțial în mediu bogat numai pentru tulpina serotip M3 MGAS10870 (Fig. 1b). Deși de ce doar MGAS10870ΔccpA tulpina arată că un defect de creștere nu este cunoscut, important, acest defect de creștere este recuperat în ccpA-tulpină completată (Fig. 1b) atribuind absența ccpA ca cauză principală a defectului de creștere. În concordanță cu observațiile anterioare pentru tulpinile serotipului M1, inactivarea CcpA a redus dimensiunea coloniei în tulpina MGAS10870 16,39. În schimb, coloniile MGAS6180 erau uniform mici și neafectate de pierderea ccpA (Fig. Suplimentar S1).

abordare

Caracterizarea tulpinilor serotipice GAS M și a acestora ccpA derivate.

(A) Filogenia genomului întreg al tulpinilor GAS secvențiate. Genomurile GAS complete ale serotipurilor M indicate (albastru) au fost obținute de la NCBI. Relațiile au fost deduse din 68.084 nuclei polimorfism nucleotidic (SNP) loci folosind SplitsTree. Localizarea tulpinilor parentale utilizate în această lucrare sunt prezentate în roșu. (b) Curbele de creștere pentru tipul sălbatic, ccpA-tulpini inactivate și completate în THY. Punctele de date sunt deviații medii și standard de la probele duplicate ale fiecărei tulpini măsurate în două ocazii independente.

CcpA afectează virulența GAS în mai multe modele de infecție

Efectul ccpA deleția asupra virulenței tulpinilor de serotip GAS la modelele de infecție la șoareci.

Șoarecii elvețieni CD-1 au fost inoculați cu tulpini GAS prin intraperitoneal (A) sau intranazal (b) traseu. Șoarecii au fost monitorizați până la aproape mortalitate pentru modelul de bacteremie (A) și supraviețuirea a fost reprezentată grafic. Pentru modelul orofaringian (b), tampoane de gât au fost obținute zilnic și densitatea bacteriană a fost reprezentată grafic. Valorile P au fost derivate din analiza măsurilor repetate (vezi Metode).

Folosind o abordare multi-serotip pentru a defini regulatorul central GAS CcpA

Efectul ccpA ștergere pe transcriptomul GAS.

(A) Reprezentarea liniară a genomului tulpinilor de serotip GAS care arată efectul ccpA-inactivarea expresiei genice descrisă ca o modificare a pliului de log. (b) O diagramă Venn ponderată care afișează distribuția și suprapunerea genelor afectate de CcpA în toate cele trei serotipuri a fost generată folosind aplicația BioVenn 60. Săgețile indică numărul de gene reprimate (în jos) și activate (în sus) de CcpA în serotipurile individuale și în regulonul central. (c) Genele afectate de CcpA în fiecare serotip sunt prezentate în ordinea categoriilor de COG. Fiecare cerc colorat indică îmbogățirea unui COG specific în tulpina serotipului. [C] Producerea și conversia energiei; [E] Transportul și metabolismul aminoacizilor; [G] Transportul și metabolismul carbohidraților; [I] Transportul și metabolismul lipidelor; [J] Traducere, structură ribozomală și biogeneză; [L] Replicarea, recombinarea și repararea; [M] Biogeneza peretelui celular/membrană/înveliș; [N] Motilitatea celulelor; [O] Modificare posttranslatională, schimbarea proteinelor, chaperone; [R] Numai predicția funcției generale; [S] Funcție necunoscută; [U] Trafic intracelular, secreție și transport vezicular.

Pentru a înțelege mai bine impactul funcțional al regulonului CcpA între serotipuri, am atribuit gene într-un grup de grupuri ortoloage (COG). Cinci COG s-au îmbogățit în mod constant în toate cele trei serotipuri, dintre care transportul și metabolismul carbohidraților [G] au cuprins cel mai mare număr de gene (Fig. 3c). S-a raportat că două dintre aceste COGS, G și S, domină genele influențate de CcpA în alți agenți patogeni gram-pozitivi 20,27,31,42. Cu toate acestea, mai multe COG, cum ar fi M (peretele celular/membrana/biogeneza învelișului), R (numai predicția funcției generale) și E (transportul și metabolismul aminoacizilor), care fuseseră identificate anterior ca parte a regulonului CcpA la alte specii 31, 42 au fost îmbogățite doar într-unul sau două dintre serotipurile GAS studiate aici, sugerând că aceste COG-uri particulare pot face parte din regulonul CcpA specific tulpinii, mai degrabă decât un aspect central al fiziologiei CcpA.

Având în vedere impactul critic al CcpA asupra patogenezei GAS, am determinat modul în care inactivarea CcpA a afectat nivelurile cunoscute ale transcrierii genei virulenței. Interesant este că doar cele nouă operon genice care codifică citolizina, streptolizina S (sagA-sagI) 44, a fost influențat de CcpA în fiecare serotip (Fig. Suplimentară S5). S-a observat variație specifică serotipului dependent de CcpA pentru degradarea IL-8 Streptococcus pyogenes proteinaza învelișului celular (SpyCEP) și endoglicozidazele care scindează imunoglobulina (EndoS) (Fig. S5 suplimentar) 45,46. Regiunile promotoare ale spyCEP și endoS genele nu conțineau distincții clare pentru a explica diferențele specifice serotipului. Luate împreună, concluzionăm că abordarea transcriptomică multi-serotipică a permis clarificarea regulonului de bază CcpA.

Funcţional cre site-urile sunt extrem de conservate în serotipurile GAS

Distribuția de cre și cre2 motive.

(A) Procentul de cre și cre2-purtând operoni care prezintă expresie diferențială dependentă de CcpA (DE) sau nu (nu), în cele trei tulpini de serotip GAS. (b) Distribuția genelor regulonului central pe baza prezenței (cre) sau absență (non-cre) a cre site în promotor. (c) Gene reglate diferențial care conțin cre sau cre2 operatorii afișați cu procente relative care sunt reprimate (sus) sau activate (jos) în ΔccpA. (d) Un numar de cre și cre2 site-urile din nucleul GAS CcpA regulon descrise ca o diagramă Venn.

In comparatie cu cre și cre2 site-urile din regulamentul GAS CcpA

GAZ îmbunătățit cre motiv.

Reprezentarea Weblogo a GAZ cre motiv consens. Frecvența de apariție a nucleotidelor pentru toate siturile cre de bază ale GAS este comparată cu cea raportată pentru B. subtilis 43. Poziții care prezintă diferențe notabile între S. pyogenes și B. subtilis sunt marcate cu casete roșii.

Predicția de cre operatorii în alți agenți patogeni gram-pozitivi.

Suita de cre site-uri prevăzute pentru (A) S. pneumonie și (b) S. aureus folosind creGAS și prin RegPrecise (RP) sunt comparate și afișate ca diagrame Venn (apeluri). Baza de date RegPrecise a fost accesată în noiembrie 2015. Cre site-urile care au raportat dovezi experimentale ale expresiei dependente de CcpA sunt afișate în panoul inferior (gene reglementate).

Concluzii

Aici, am folosit o abordare multi-serotip pentru a clarifica nucleul GAS CcpA regulon, care am constatat că constă în principal din gene reprimate care sunt susceptibile de a fi direct afectate de CcpA, având în vedere prezența cre elemente. Puterea acestei metode este exemplificată de faptul că doar 173 din cele 540 de gene (32%) reglementate diferențial în cele trei serotipuri au fost afectate în toate cele trei tulpini. Astfel, datele noastre sugerează că multe dintre transcriptomele CcpA publicate anterior sunt susceptibile să conțină efecte secundare specifice de tulpină ale inactivării CcpA. Am îmbunătățit creMotivul GAS derivat din datele transcriptomului cu mai multe tulpini ar trebui să faciliteze o acuratețe mai mare in sillico predicția genelor reglementate de CcpA într-o gamă largă de agenți patogeni.

Interesant, am observat că o proporție semnificativă a regulonului de bază CcpA (55%) este non-cre-ținând. Această observație ar putea indica o nedescoperită, non-cre-modul bazat pe reglementarea CcpA, cum ar fi cre2 motiv propus recent în S. suis 42. Cu toate acestea, chiar încorporarea cre2 motivul a reprezentat doar 15 gene suplimentare în regulonul central. Rămâne posibil ca nucleele de regulă ale GAS CcpA să nu aibă gene cre sau cre2 siturile fac parte din rețeaua de reglare transcripțională a unui regulator afectat de CcpA, având în vedere că regulonul de bază CcpA include cel puțin două TCS, opt regulatori independenți și două proteine ​​antiterminatoare transcripționale (tabelul suplimentar S1).

Conceptul de regulatori metabolici ca determinanți ai virulenței este susținut de faptul că capacitatea unui agent patogen de a prospera necesită capacitatea de a exploata sursele de hrană din gazdă, care la rândul său se bazează pe controlul căilor metabolice. Astfel, o înțelegere suplimentară a funcției CcpA ar putea ajuta la dezvoltarea unor noi strategii de prevenire sau terapeutice aplicabile pentru numeroși agenți patogeni gram-pozitivi.

Metode

Declarație de etică

Experimentele cu șoareci au fost efectuate conform protocoalelor aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor MD Anderson (numărul protocolului: 00000808). S-au făcut toate eforturile pentru a minimiza suferința.

Tulpini bacteriene, medii și creștere

Toate tulpinile utilizate în acest studiu sunt enumerate în Tabelul S5. Grupa A streptococ Tulpinile (GAS) au fost cultivate în mod obișnuit în mediu Todd-Hewitt suplimentat cu 0,2% extract de drojdie (THY) la 37 ° C cu 5% CO2. Cloramfenicolul (4 ug/ml) și spectinomicina (150 ug/ml) au fost utilizate pentru a selecta plasmidele care completează CcpA și, respectiv, inactivează CcpA. Mutageneză de inserție nepolară a fost folosită pentru a obține izogen ccpA mutanți în fiecare dintre tulpinile de serotip, așa cum s-a descris anterior pentru MGAS2221 39. ccpA gena din fiecare tulpină de serotip a fost utilizată pentru a crea plasmida lor complementară CcpA, așa cum s-a descris anterior 39 și introdusă în acești mutanți pentru complementarea genetică. Mutanții și tulpinile completate au fost verificate prin Southern blots și qRT-PCR ccpA și gene cunoscute reglementate de CcpA (date neprezentate) așa cum s-a descris anterior 50 .

Studii pe animale

Pentru qRT-PCR în timp real Taqman, tulpinile au fost crescute în duplicat în două ocazii separate până la faza mijlocie exponențială în THY și prelucrate așa cum a fost descris anterior 50. Nivelul transcrierii genei între tipul sălbatic și ccpA-derivatul inactivat al fiecărei tulpini de serotip a fost comparat utilizând un ANOVA obișnuit într-un singur mod. Amorsele și sondele utilizate sunt enumerate în Tabelul S5.

In Silicon Identificarea regulonului CcpA

Regulonul CcpA a fost prezis in Silicon folosind o strategie clasică de matrice de greutate probabilistică 57. Pe scurt, am considerat un operon ca un grup de gene care codifică în aceeași direcție, cu mai puțin de 50 de perechi de baze între ele 58. Am generat două matrici independente ale greutății consensului site-ului de legare CcpA conform datelor raportate anterior 42.43. Folosind algoritmul MAST 59, fiecare dintre matrici a fost utilizată pentru a selecta 150 bp în amonte și 50 bp în aval de fiecare operon conținut în tulpinile MGAS2221, MGAS6180 și MGAS 10870 S. pyogenes genomi. În cele din urmă, am acceptat numai acele predicții ale site-ului de legare CcpA care au prezentat o similitudine mai mare de 70% cu matricea consensuală corespunzătoare. Folosind secvențele prezente ale site-ului de legare CcpA conservate în regulonul central, am generat noua matrice de consens, creGAS și a examinat genomul complet al S. pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3) și S. aureus Newman (NC_009641.1).

informatii suplimentare

Cum să citiți acest articol: DebRoy, S. și colab. O abordare multi-serotip clarifică regulonul proteinei A de control al catabolitului în grupul principal de agenți patogeni umani Streptococ. Știință. reprezentant. 6, 32442; doi: 10.1038/srep32442 (2016).