• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: evans @ salk.eduyzheng @ salk.edu

Abstract

A, Imagine a controlului și a splinei PPAR TKO și a ganglionilor limfatici. b, Greutatea splinei. c, d, Treg (c) și activat Tconv (d) frecvența celulelor în splină și LN. e, Dezvoltarea subseturilor de celule T din timus. n = 3 șoareci per grup. LN, ganglion limfatic. Testul t al studentului.

imunopatologia

A, Gruparea ierarhică de gene exprimate diferențial între celulele TH2 suficiente sau deficiente în Pparg tratate cu celule rosiglitazonă (Rosi) sau dimetil sulfoxid (DMSO) grupate de la 4 șoareci, același set de date utilizat în c-f). b, Motivul ADN-ului cel mai bine marcat al vârfurilor PPAR ChIP-Seq din celulele TH2 prin analiza de novo (celule grupate de la 4 șoareci, același set de date utilizat c-f). c, Graficul Circos reprezentând liste genetice din grupurile Rosi Up, Rosi Down I și Rosi Down II împreună cu listele de vârf din PPAR ChIP-Seq a celulelor TH2. Arcurile violete leagă nume identice de gene din două liste diferite. d, Grafic cu bare reprezentând valorile P ale clusterelor de ontologie genică cu P −10 din listele de gene indicate. Fiecare cluster este etichetat cu cel mai reprezentativ termen de ontologie genică pentru acel cluster. e, f, FPKM selectat și valorile de vârf corespunzătoare PPAR ChIP ale genelor din clusterul Rosi Up (e) și clusterele Rosi Down (f) care au funcții metabolice sau imunologice.

Reglarea metabolică a funcției imune are loc într-un context foarte înalt și într-un mod specific de tip celular 32-34. Pentru a înțelege în continuare mecanismul prin care reprogramarea metabolică activată cu PPARγ ar putea controla funcția imunologică în celulele TH2, am examinat gene din Clusterul Rosi Up care au fost, de asemenea, ținte directe ale PPARγ. Am găsit gene ale căror activități consensuale ar promova o nouă lipogeneză (Plin2, Gpam, Dgat1), oxidarea acizilor grași (Pdk4, Cpt1a, Acaa2, Eci2, Slc25a20, Acadl, Acsl5) și masă mitocondrială (Etfb, Mrpl45, Mrpl1), probabil se manifestă în utilizarea substratului mitocondrial al acizilor grași (Date extinse Figura 4d, e). Într-adevăr, studiile de urmărire au arătat o creștere clară a masei mitocondriale indusă de Rosi, dependentă de PPARγ (date extinse Figura 4f-h), precum și oxidarea mitocondrială a acizilor grași (date extinse Figura 4i, j) fără creșterea glucozei celulare absorbție (Figura 4k de date extinse) sau în oxidarea mitocondrială a carbonilor derivați de glucoză (Figura 4l de date extinse). În mod colectiv, aceste studii susțin PPARγ ca factor de transcripție TH2 de bază care impune capacitatea oxidativă mitocondrială necesară pentru a restrânge funcția de efect TH2 exuberantă.

Datorită capacității robuste a lui Rosi de a reduce funcția efectorului TH2 și de a aplica căile lipidice catabolice într-o manieră dependentă de PPARγ in vitro, am emis ipoteza că poate tratamentul cu Rosi ar putea fi utilizat pentru a proteja șoarecii obezi de AD exacerbată. În mod remarcabil, șoarecii tratați cu Rosi au redus substanțial boala, măsurată printr-o reducere de ~ 40% a creșterii grosimii urechii (Figura 4a, b), reducerea marcată a infiltrației limfocitare (Figura 4c) și o scădere semnificativă a competenței IL-4 Celulele Tconv (Figura 4d), efecte care au fost în mare măsură dependente de PPARγ specific celulei T. Interesant, am observat efecte ale Rosi care nu au fost dependente de PPARγ specific celulelor T, inclusiv o creștere modestă a severității bolii (Figura 4a-c) și o reducere a celulelor Tconv competente IFNγ (Figura 4e), posibil legate de T mecanisme celulare-extrinseci de acțiune PPARγ, care s-a dovedit a fi exprimate în mai multe tipuri de celule ale pielii, cum ar fi adipocite, sebocite, foliculi de păr și keratinocite 35 .

A, Modificarea grosimii urechii în timpul dezvoltării dermatitei atopice cu șoareci alimentați cu dietă HFD sau HFD cu Rosi. b, Grosimea absolută a urechii în ziua 11. Linia punctată indică grosimea medie a urechii în ziua 0 a tuturor șoarecilor din studiu. c, Imagini reprezentative ale histologiei colorate a hematoxilinei și eozinei urechilor în ziua 11. Bare de scară, 100μm. d, e, Celule IL-4 + Tconv totale (d) și celule IFN + Tconv (e) din toată urechea în ziua 11. PPAR TKO, CD4 Cre PPAR fl/fl; n = 5 pentru toate grupurile, cu excepția (e) unde 4 șoareci martori au fost tratați cu dietă HFD sau HFD cu Rosi. Datele sunt medii ± s.e.m. * P evanssalk.edu) sau Y.Z. (yzhengsalk.edu).

Dezvăluiri privind conflictele de interese

A.M. este cofondator al Arsenal Biosciences și Spotlight Therapeutics. A.M. face parte din consiliul consultativ științific al PACT Pharma, este consilier al Trizell și fost consilier al Juno Therapeutics. Laboratorul Marson a primit sprijin de cercetare sponsorizat de la Juno Therapeutics, Epinomics, Sanofi și un cadou de la Gilead. R.L.G. este consultant și are participații la MatriSys Biosciences și Sente Inc. Toți ceilalți autori neagă orice conflict de interese.

Materiale și metode

Toți șoarecii au fost găzduiți în facilitățile specifice fără patogeni de la Institutul Salk pentru Studii Biologice sau au fost achiziționați de la Laboratorul Jackson. Șoarecii PPARγ TKO au fost generați prin încrucișarea șoarecilor transgenici CD4Cre 1 și șoarecii Pparg fl/fl (ref. 2). Am folosit șoareci reporteri Foxp3 Thy1.1 (ref. 3) la izolarea celulelor Treg și Tconv CD4 + din splină și ureche pentru analiza ulterioară a ARN-ului. Șoarecii din cadrul Institutului Salk pentru Studii Biologice au primit chow normal autoclavat (dieta de rozătoare de laborator MI 5001, Harlan Teklad), HFD iradiat (60 kcal% grăsimi, Research Diets), HFD iradiat amestecat cu rosiglitazonă (15 mg kg -1 de alimente, Cercetare Diets) sau DMSO (Research Diets) sau ND (10 kcal% grăsime, Research Diets). Toți șoarecii utilizați pentru studii au fost bărbați. Toate procedurile care implică animale au fost efectuate în conformitate cu protocoalele aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) și Departamentul de resurse animale (ARD) al Institutului Salk pentru Studii Biologice.

Dermatita atopică experimentală indusă de MC903

Șoarecii au fost anesteziați prin izofluran și soluția MC903 (0,1 mM în etanol, 10 μL/ureche, sisteme de cercetare și dezvoltare) a fost aplicată zilnic pe urechile șoarecilor timp de 9-12 zile. Grosimea urechii a fost evaluată utilizând un micrometru (Mitutoyo, # 227-211). La recoltare, urechile au fost disecate de la șoareci și pregătite pentru analize histologice sau citometrie de flux.

Suspensie unicelulară de celule imune care se infiltrează în urechi

Urechile disecate au fost tocate în bucăți fine (1-2 mm 3) și digerate într-un tampon de izolare vasculară stromală (HBSS cu calciu și magneziu, 20 mg/ml BSA, 20 mg/ml penicilină, 20 mg/ml streptomicină) conținând 2 mg ml - 1 Colagenază D (Roche) la 37 ° C cu agitare intermitentă timp de 2 ore. Suspensia a fost apoi trecută printr-o plasă de 100 μm pentru a îndepărta aglomerările și resturile nedigerate. Fluxul a fost centrifugat la 400 RCF timp de 10 min. Peleta care conține fracția vasculară stromală a fost spălată o dată în 10 ml RPMI, iar celulele izolate rezultate au fost supuse analizei FACS direct sau mai întâi stimulate cu PMA și ionomicină în prezența brefeldin A (GolgiPlug; BD) timp de 5 ore la 37 ° C pentru colorarea ulterioară a citokinelor intracelulare și analiza FACS.

Analize histologice

Secțiunile (4 μm) de țesuturi fixe au fost colorate cu hematoxilină și eozină conform procedurilor standard. Analizele histopatologice au fost efectuate pe probe orbite pentru severitatea și gradul inflamației și modificările morfologice de către un patolog.

Citometrie în flux

Au fost utilizați următorii anticorpi. Biolegend: CD4 (RM4-5), CD8 (53-6.7), CD25 (7D4), CD44 (IM7), CD45.2 (104), CD62L (MEL-14) și IFN-y (XMG1.2); eBioscience: Foxp3 (FJK-16s), IL-4 (11B11), IL-13 (eBio13A), TCRβ (H57-597). Pentru colorarea intracelulară, celulele au fost tratate cu reactivi de fixare și permeabilizare de la BD sau eBioscience (pentru colorarea Foxp3) și etichetate cu anticorpi corespunzători înainte de a fi analizate pe un sortator de celule BD FACSAria. Datele au fost analizate folosind instrumentul BD FACSAria (Becton Dickinson) și software-ul FlowJo (FlowJo LLC).

Diferențierea in vitro a celulelor T CD4 +

Celulele T CD4 + au fost izolate din splină și ganglioni limfatici folosind trusa EasySep Mouse CD4 de selecție pozitivă II (Stemcell Technologies). Celulele T Naive (CD25 - CD44 hi CD62L lo) CD4 + au fost sortate prin citometrie în flux din celulele T CD4 + purificate cu mărgele. Celulele T CD4 + naive au fost resuspendate în mediu Click (Irvine Scientific) la 1 milion de celule pe ml și apoi placate în ziua 0 în plăci cu 24 de godeuri acoperite cu anticorp IgG de capră-hamster (200ng/ml; MP Biomedicals) cu adăugarea de anti-CD3 solubil (1μg/ml; 145-2C11) și anti-CD28 (1μg/ml; 37,51) din Bio X Cell. Condițiile de polarizare pentru diferite subseturi T helper sunt următoarele: TH1: hIL2 (100U/ml; PeproTech), mIL-12 (20ng/ml; PeproTech) și anti-IL-4 (5μg/ml; Bio X Cell); TH2: hIL2 (100U/ml; PeproTech), mIL-4 (20ng/ml; Biolegend), anti-IFN-γ și anti-IL-12 (5μg/ml; Bio X Cell); TH17: mIL-6 (20ng/ml; Biolegend), hTGF-β (2ng/ml; PeproTech), anti-IFN-γ și anti-IL-12 (5μg/ml; Bio X Cell). Când este indicat, Rosi a fost dizolvat în DMSO și adăugat la o concentrație finală de 10 μM în Ziua 0 și Ziua 3 a culturilor de 4-5 zile.

Grunduri pentru qPCR

Il4 - Pentru: AGGAGCCATATCCACGGATGCGA, Rev: TGTTCTTCGTTGCTGTGAGGACGT;

Il13 - Pentru: CACAGAAGACCAGACTCCCC, Rev: GTTGGTCAGGGAATCCAGGG;

Pparg - Pentru: CACAATGCCATCAGGTTTGGG, Rev: GAAATGCTTTGCCAGGGCTC;

Gata3 - Pentru: CTTCCCACCCAGCAGCCTGC, Rev: CGGTACCATCTCGCCGCCAC;

Tbx21 - Pentru: GTCGCGCTCAGCAACCACCT, Rev: CGGCCACGGTGAAGGACAGG;

Rorc - Pentru: CCGGACATCTCGGGAGCTGC, Rev: CGGCGGAAGAAGCCCTTGCA;

Gapdh - Pentru: CAAGGTCATCCATGACAACTT, Rev: GGCCATCCACAGTCTTCTGG;

Hprt - Pentru: GTCATGCCGACCCGCAGTCC, Rev: GGCCACAATGTGATGGCCTCCC;

CoI - Pentru: TGCTAGCCGCAGGCATTAC, Rev: GGGTGCCCAAAGAATCAGAAC;

Ndufv1 - Pentru: CTTCCCCACTGGCCTCAAG, Rev: CCAAAACCCAGTGATCCAGC.

Anticorpi pentru western blot

Rabbit anti-PPARγ mAb (81B8, Cell Signaling), mouse anti-NDUFB8 mAb (20E9DH10C12, Invitrogen), mouse anti-Tubulin (DM1A, Sigma).

Generarea bibliotecii ChIP-Seq

Celulele T CD4 + naive au fost activate și polarizate în condiții TH2. În ziua 1 și 2, celulele T au fost transduse cu un vector retroviral care exprimă Pparg marcat cu TY1. În ziua 4, celulele T transduse au fost recoltate pentru ChIP așa cum s-a descris anterior 4 utilizând un anticorp TY1 (Sigma, SAB4800032). Bibliotecile de secvențiere ChIP au fost construite și secvențiate (50 bp single end reads) așa cum a fost descris anterior 4. Citirile scurte de ADN au fost demultiplexate folosind Illumina CASAVA v1.8.2. Citirile au fost aliniate cu genomul de referință al mouse-ului mm10 folosind aliniatorul Bowtie2 cu parametri standard care permit până la 2 nepotriviri pe citire. Apelurile de vârf, analizele de motive și alte analize de date au fost efectuate folosind HOMER, o suită software pentru analiza ChIP-seq, așa cum a fost descris anterior 4. Vizualizarea rezultatelor ChIP-Seq a fost realizată prin încărcarea pieselor personalizate pe browserul genomului UCSC.

Analiza generării și secvențării bibliotecii RNA-Seq

ARN-ul total a fost extras din celulele TH2 la 96 de ore după inițierea diferențierii in vitro. Bibliotecile de secvențiere ARN au fost preparate din ARN total de 100 ng (TrueSeq v2, Illumina) și secvențierea cu un singur capăt a fost efectuată pe Illumina HiSeq 2500, folosind multiplexare codată în bare și o lungime de citire de 100 bp, obținând o mediană de 34,1M citiri pe probă. Alinierea citirii și găsirea joncțiunii au fost realizate folosind STAR 5 și expresia diferențială a genei cu Cuffdiff 2 6, utilizând UCSC mm10 ca secvență de referință. Expresia transcrierii a fost calculată ca abundență relativă la nivel de genă în fragmente pe kilobază de transcriere pe milion de fragmente mapate și s-a folosit corecția pentru polarizarea abundenței transcrierii 7. Metascape 8 a fost utilizat pentru adnotarea funcțională a genelor. Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus) a fost folosit pentru gruparea ierarhică. Circos (https://circos.ca) a fost angajat la realizarea parcelelor Circos 9 .

IL-4 ELISA

Celulele T CD4 + naive au fost diferențiate in vitro în condiții de polarizare TH2 așa cum este descris mai sus în plăci cu 24 de godeuri. La 96 de ore după activarea inițială, celulele au fost colectate, spălate de două ori cu PBS și resuspendate în mediu de polarizare TH2 fără IL-4 în plăci cu 24 de godeuri. Celulele au fost cultivate timp de încă 48 de ore și apoi mediul condiționat a fost colectat pentru a cuantifica conținutul de IL-4 prin ELISA (BioLegend, Mouse IL-4 ELISA MAX Seturi Standard) utilizând absorbanță la 490 nm ca citire.

Fenotipare metabolică prin analiza fluxului extracelular

Dependența substratului mitocondrial și nivelurile maxime de respirație au fost determinate prin evaluarea ratei consumului de oxigen (OCR). OCR a fost măsurat folosind un analizor de flux extracelular cu 96 de godeuri (Seahorse Bioscience). Pe scurt, celulele moarte au fost îndepărtate din culturile de celule T utilizând Ficoll-Paque Premium 1.084 (17-5446-02; GE). 4 × 105 celule vii per godeu (în general 5 godeuri pe probă) au fost rotite pe o placă de Seahorse acoperită cu Cell Tak (Corning) și odihnite timp de 1 oră într-un incubator fără CO2 la 37 ° C înainte de a începe măsurările folosind instrumentul Seahorse Așa cum se indică în figuri, s-au adăugat următoarele medicamente în godeuri (concentrația este concentrația finală în godeuri): Oligomicină A (10 μM, Sigma), FCCP (5 μM, Sigma), Rotenonă (7,5 μM, Sigma), Antimicină A 7,5 μM, Sigma), Etomoxir (100 μM, Sigma), UK5099 (2 μM, Sigma).

Test de oxidare a acidului gras

Analiza absorbției de glucoză

PPARγ TKO și celule CD4 + T naive de control au fost activate și polarizate în condiții TH2 timp de 5 zile. Rosi sau DMSO s-au adăugat la o concentrație finală de 10 μM în Ziua 0 și Ziua 3,5 milioane de celule pe probă au fost resuspendate în 1 ml de tampon KRBH (Krebs-Ringer bicarbonat HEPES) la pH de 7,4 (120 mM NaCI; 4 mM KH2PO4; 1 mM MgSO4; 0,75 mM CaCl2; 30 mM HEPES; 10 mM NaHCO3) și distribuit în mod egal în 5 godeuri ale unei plăci cu 24 de godeuri. Celulele au fost incubate timp de 30 min într-un incubator la 37 ° C și apoi tratate cu 50 μL/godeu de tampon de încărcare (0,5 mM 2-DG (2-Deoxi-D-glucoză) și 0,5Ci (3H-2DG)). Godeurile de control negative au fost tratate suplimentar cu 10 μL/godeu de 1,5 mM de citocalazină B în DMSO pentru a suprima captarea activă a glucozei și controlul pentru absorbția nespecifică și legarea 3 H-2-DG. Celulele au fost incubate timp de 1 oră la 37 ° C și apoi spălate de trei ori cu PBS. Celulele au fost lizate în 300 pl de NaOH 0,1 N. S-au colectat 200 μL de liză/probă celulară pentru măsurători de radioactivitate prin contor de scintilație. Cantitatea rămasă a fost utilizată pentru a efectua testul Bradford pentru a cuantifica concentrația de proteine. Toate numărurile de radioactivitate au fost normalizate la concentrația de proteine ​​din eșantion, iar numărul de control negativ a fost scăzut în continuare din măsurătorile experimentale ale eșantionului.

Analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate cu Prism 8 (GraphPad). Valorile P au fost calculate utilizând testul t al Studentului cu două cozi, nepereche sau asociat. Mărimea cohortei de șoareci a fost concepută astfel încât să fie suficientă pentru a permite determinarea exactă a semnificației statistice. După caz, șoarecii au fost repartizați aleatoriu în grupuri de tratament sau de control. Niciun animal nu a fost exclus din analiza statistică, cu excepția excluderilor datorate erorilor tehnice, iar anchetatorii nu au fost orbiți în studii. Au fost aplicate analize statistice adecvate, presupunând o distribuție normală a eșantionului, așa cum se specifică în legendele figurii. Nu s-a făcut nicio estimare a varianței între fiecare grup. Toate experimentele in vivo au fost efectuate cu cel puțin două cohorte independente. Toate experimentele in vitro de diferențiere TH au fost efectuate de cel puțin trei ori. Experimentele ChIP-Seq și ARN-Seq au fost efectuate folosind mai multe probe biologice (așa cum se indică în legendele din figură).