Tingting Li

1 Colegiul de Științe ale Vieții, Universitatea Dalian Minzu, Dalian, China

condițiilor

Likun Ren

2 Colegiul de Știință și Tehnologie Alimentară, Universitatea Bohai, Jinzhou, China

Dangfeng Wang

2 Colegiul de Știință și Tehnologie Alimentară, Universitatea Bohai, Jinzhou, China

Minjie Song

2 Colegiul de Știință și Tehnologie Alimentară, Universitatea Bohai, Jinzhou, China

Qiuying Li

2 Colegiul de Știință și Tehnologie Alimentară, Universitatea Bohai, Jinzhou, China

Jianrong Li

2 Colegiul de Știință și Tehnologie Alimentară, Universitatea Bohai, Jinzhou, China

Date asociate

b Randament de extracție (%) = (conținut de purină în probă (mg)/masa probei (kg)) × 100

b Randament de extracție (%) = (conținut de purină în probă (mg)/masa probei (kg)) × 100

Următoarele informații au fost furnizate cu privire la disponibilitatea datelor:

Măsurătorile brute sunt disponibile în fișierul S1.

Abstract

fundal

Guta este a doua cea mai frecventă boală metabolică care afectează sănătatea umană. Boala gutei este strâns legată de nivelul acidului uric, care este produsul final al metabolismului purinei umane. Mai mult, mâncarea este principala cale de ingestie externă de purină.

Metodă

O metodă simplă și care economisește timp a fost dezvoltată pentru a extrage purinele precum adenina, hipoxantina, guanina și xantina din peștii marini prin design cu un singur factor combinat cu Box - Behnken. Conținutul acestor purine din părțile comestibile și organele interne ale peștilor marini, precum și Scophthalmus maximus, au fost determinate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță pentru a investiga relația dintre procesul de fierbere și conținutul de purină.

Rezultat

Metoda cu acid mixt a fost aleasă pentru extracția bazelor purinice și condițiile de extracție au fost după cum urmează: amestec acid 90,00% TFA/80,00% FA (v/v, 1: 1); temperatura de hidroliză 90,00 ° C; timp 10.00 min; raport lichid-solid 30: 1. Conținutul total de purină al părților comestibile (ochi, mușchi dorsali, mușchi abdominali și piele) a fost cel mai ridicat în Scophthalmus maximus, urmat de sphyraena, Sardinella, Trichiurus lepturus, Scomberomorus niphonius, Pleuronectiformes, somn de mare, Anguillidae și Rajiformes. Mai mult, fierberea a redus semnificativ conținutul de purină din peștele marin din cauza transferului purinelor în lichidul de gătit în timpul fierberii. Scophthalmus maximus, Sphyraena și Sardinella erau considerați ca pești marini cu conținut ridicat de purină, pe care ar trebui să-i mâncăm mai puțin. De asemenea, am confirmat că fierberea a transferat în mod semnificativ bazele purinice din pește în lichidul de gătit. Astfel, fierberea ar putea reduce conținutul de purină al peștilor, reducând astfel riscul de hiperuricemie și gută.

Introducere

Guta este un tip de artrită inflamatorie cauzată de depunerea cristalelor monosodice în țesuturi. A devenit a doua cea mai frecventă boală metabolică care afectează sănătatea umană (Goldberg și colab., 2017). Conform statisticilor, aproximativ 75 de milioane de oameni din China suferă acum de gută sau hiperuricemie. Aceste boli sunt puternic influențate de acidul uric, care este un metabolit al componentelor purinice ale ARN și ADN prezente în alimente. Nivelurile normale de urat seric la adulții sănătoși sunt sub 0,45 mmol/L la bărbați și sub 0,36 mmol/L la femei (Zhao și colab., 2005). Cu toate acestea, atunci când acidul uric din sânge depășește nivelurile normale, există un risc crescut de boli precum guta.

În această lucrare, este raportată o metodă simplă și fiabilă pentru extracția purinei. Mai mult, conținutul de purină (adenină, guanină, hipoxantină și xantină) din părțile comestibile a nouă pești marini a fost măsurat prin HPLC. În cele din urmă, efectul fierberii asupra conținutului de purină din părțile comestibile ale peștilor marini a fost investigat în contextul viabilității sale în scăderea riscului de atacuri de gută cauzate de dietă.

Material si metode

Substanțe chimice și reactivi

Standardele de purină (adenină, guanină, hipoxantină și xantină) au fost achiziționate de la Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd (Shanghai, China). Standardele au fost toate de calitate cromatografică cu puritate> 98%. Acidul acetic glacial de nivel cromatografic, alcoolul metilic, hidroxidul de tetrabutilamoniu și acidul trifluoroacetic (TFA) au fost, de asemenea, obținute de la Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd. Acidul formic analitic pur (FA) și acidul percloric (PCA) au fost cumpărate de la Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Co., Ltd (Tianjin, China). Apa a fost purificată printr-un sistem Milli-Q (Millipore, Burlington, MA, SUA).

Eșantionare și pretratare

Colectie de mostre

Peștii marini vii (Scophthalmus maximus, Scomberomorus niphonius, Trichiurus lepturus, Pleuronectiformes, somn de mare, Sardinella, Sphyraena, Anguillidae și Rajiformes) au fost cumpărați de pe piața locală cu ridicata a fructelor de mare din Jinzhou, China, transportați la laborator unde au fost uciși apoi mușchii dorsali, mușchii abdominali, pielea, ochii și viscerele au fost îndepărtați pentru testare. Toate probele au fost tocate și depozitate la 0 ° C înainte de a continua.

Prelucrare preliminară

Părțile comestibile ale peștilor marini (mușchii dorsali, mușchii abdominali și pielea) au fost fierte separat în apă timp de 3, 6, 9, 12 și 15 minute și conținutul bazelor de purină din toate probele (părți comestibile și gătit) lichide) au fost determinate. Probele nefierte au fost utilizate ca grup de control. Au fost luate trei măsurători independente, iar media și abaterile standard au fost calculate.

Stabilirea metodei de extracție a purinei

Bazele de purină din probe au fost extrase conform metodei Piñeiro-Sotelo, López-Hernández & Simal-Lozano (2002), cu unele modificări. Mai întâi, s-au adăugat 200 mg de probă într-un tub de centrifugă (50 ml) cu 10 ml de acid și s-au încălzit la 90 ° C într-o baie de apă timp de 15 minute. Apoi, hidrolizatul acid a fost plasat într-un evaporator rotativ la 75 ° C pentru a îndepărta substanțele volatile, și apoi redizolvat în 10 ml de fază mobilă HPLC (apă-metanol-acid acetic glacial-20% hidroxid de tetrabutilamoniu (v/v = 879/100/15/6) În cele din urmă, proba a fost centrifugată la 8.000 g timp de 10 minute la 4 ° C și filtrată printr-un filtru de 0,22 μm înainte de analiză prin HPLC.

Proiectare cu un singur factor

Metoda PCA

Condițiile optime pentru extracția bazelor de purină prin metoda PCA au fost determinate de metoda cu factor unic și de proiectarea Box-Behnken (BBD). Hidroliza a fost efectuată în urma procedurii raportate de Piñeiro-Sotelo, López-Hernández și Simal-Lozano (2002), cu unele modificări. O metodă cu un singur factor a fost utilizată în acest studiu. Au fost investigați patru factori care includ concentrații de PCA (5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% și 100%), temperatura băii de apă 30, 40, 50, 60, 70, 80 și 90 ° C), timpul de hidroliză (35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 și 70 min) și raportul lichid-solid (10: 1, 20: 1, 30: 1, 40: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1). Când un factor a fost studiile, alții au fost stabiliți în valoarea optimă determinată în această lucrare.

Metoda amestecului acid

Metoda mixtă a acidului a fost optimizată într-un mod similar cu metoda PCA. Au fost efectuate experimente cu un singur factor pentru a examina influența temperaturii în baia de apă (30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 și 100 ° C), lichid-solid (10: 1, 20: 1, 30: 1, 40: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1), concentrația de TFA și FA (45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90% și 95%) și timpul de hidroliză (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 și 60 min) în eficiența extracției. Efectul fiecărui factor a fost explorat prin schimbarea factorului, menținând în același timp alți factori constanți.

Plackett - Design burman pentru factorii de screening

În acest studiu, au fost selectați cinci factori independenți, cum ar fi temperatura de hidroliză, timpul de hidroliză, concentrația FA, concentrația TFA și raportul lichid la solid pentru a investiga factorii eficienți ai randamentului ridicat de extracție a purinei. Conform rezultatului unui test cu un singur factor, fiecare variabilă a fost studiată la două niveluri (Farrokhnia și colab., 2016): scăzut (-1) și ridicat (+1) care au fost selectate din intervalul maxim de răspuns al fiecărei variabile independente (Tabelul 1). Un total de 12 rulări experimentale au fost proiectate de software-ul Design Expert-8.0.6 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, SUA). Rezultatele PBD au fost analizate pentru a selecta cei mai importanți factori, care au fost în continuare optimizați utilizând BBD.

tabelul 1

Variabile Nivele
Coduri de factoriFactorUnitățiScăzut (−1)Înalt (+1)
ATemperatura hidrolizei° C80100
BRaport lichid-solidml/g2040
CConcentrația de FA%7585
DConcentrația de TFA%8090
EMomentul hidrolizei probeimin515

Box - Proiectare Behnken pentru optimizarea metodei de extracție a purinei

În acest studiu, BBD a fost utilizat pentru a găsi condițiile optime de extracție pentru a obține cel mai mare randament de extracție al purinei totale. Pe baza proiectării cu un singur factor și a PBD, au fost determinate și selectate niveluri de factori și factori critici pentru analiza metodologică a suprafeței de răspuns. Fiecare dintre aceste variabile a fost studiată la trei niveluri diferite (-1, 0, 1) (Grosso și colab., 2014). Factorii și nivelurile metodologiei suprafeței de răspuns au fost prezentate în Tabelul 2. Software-ul Design Expert 8.0.6 a fost utilizat pentru proiectarea experimentală, analiza datelor și construirea modelelor. Graficele de suprafață și conturul tridimensional au fost trasate pentru a identifica interacțiunea dintre factori și răspunsuri.

masa 2

Variabile Nivele
Coduri de factoriNumeUnitățiScăzut (−1)(0)Înalt (+1)
(a) Variabile experimentale și nivelurile acestora utilizate în metoda BBD pentru PCA.
AConcentrația de PCA%708090
BHidroliza temperaturii° C708090
CMomentul hidrolizei probeimin505560
DRaport lichid-solidml/g506070
(b) Variabile experimentale și nivelurile acestora utilizate în BBD pentru metoda mix-acid.
AHidroliza temperaturii° C8090100
BConcentrația de TFA%808590
CMomentul hidrolizei probeimin51015

Test de validare

Experimentele de verificare au fost efectuate în condițiile prezise, ​​cu unele modificate, indicând validitatea modelelor prezise. Când eroarea relativă dintre valoarea prezisă și valoarea reală a fost mai mică de 5%, a arătat că ecuația de regresie se potrivește bine cu situația reală și este precisă și fiabilă.

Condiții HPLC

Pentru identificarea bazelor de purină extrase s-a folosit un sistem Shimadzu LC-2030 HPLC (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonia) format dintr-o unitate de pompare LC-20AD, un detector UV SPD-20AV și un încălzitor pe coloană CTO-20AC. O coloană Agilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm × 250,0 mm × 5,0 μm; Agilent Technologies, Germania) a fost utilizată ca coloană analitică și menținută la 28 ° C în timpul funcționării. Faza mobilă a fost apă-metanol-acid acetic glacial-20% hidroxid de tetrabutilamoniu (v/v = 879/100/15/6, pH = 3,44), iar proba de 10 μL a fost eluată la un debit de 0,8 ml/min . La sfârșitul fiecărei proceduri, coloana analitică a fost spălată cu faza mobilă timp de 30 de minute și echilibrată înainte de următoarea rulare. Detectorul a măsurat absorbanța la 254 nm și datele au fost analizate folosind software-ul de analiză Shimadzu (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonia).

Evaluarea metodei

În cazul în care A este valoarea conținutului de purină al eșantionului care a adăugat standarde de bază purinice, B este conținutul de purină din eșantion fără standarde de bază purinice și C este conținutul cunoscut de standarde bazice de purină adăugat în eșantion.