Divizia de Nefrologie-Hipertensiune, VA San Diego Healthcare System și Universitatea din California, Școala de Medicină din San Diego, La Jolla, California

Adresa pentru cereri de reimprimare și alte corespondențe: S. C. Thomson, Div. de Nefrologie-Hipertensiune, VASDHS, 3350 La Jolla Village Dr., 9111H, San Diego, CA 92161 (e-mail: [e-mail protejat]).

Abstract

Protocoale de micropunctură.

În experimentele menite să testeze rolul macula densa NOS în TGF anormal, TGF a fost testat la unele nefroni folosind ATF standard și la alte nefroni unde blocantul NOS, N-monometil l-arginina (L-NMMA; 10-4 M) a fost adăugat la ATF. Astfel, au existat două perfuzii/colecții pe nefron în aceste experimente.

În experimentele concepute pentru a testa rolul cTGF în TGF anormal, răspunsurile TGF au fost măsurate în fiecare nefron înainte și în timpul adăugării de benzamil la perfuzat. Prin urmare, au existat patru perfuzii/colecții pe nefron. Acest lucru a fost realizat prin introducerea a două pipete de microperfuzie în aval de blocul de ceară. Una dintre aceste pipete conținea numai ATF, iar cealaltă conținea ATF plus benzamil (10 -5 M). Benzamilul este un puternic blocant ENaC (1) și răspunsurile TGF îmbunătățite în timpul microperfuziei benzamilului sunt testul obișnuit utilizat pentru a demonstra cTGF în rapoartele publicate (5, 8, 21, 22). După ce s-au făcut colectări de control al răspunsului TGF, bucla lui Henle a fost perfuzată cu benzamil și pipetele ATF s-au setat fiecare la 15 nl/min timp de 3-4 minute. În timpul stimulărilor TGF maxime și minime, pipeta benzamil a fost setată la 15 sau respectiv 8 nl/min, iar pipeta ATF a fost ajustată pentru a da rata de perfuzie totală adecvată. Pentru microanaliză, fiecare colecție de fluid tubular a fost transferată într-o pipetă de sticlă cu foraj constant pentru a măsura debitul proximal târziu (VLP). Apoi, proba a fost numărată pentru radioactivitate pentru a determina SNGFR.

Statistici.

Analiza statistică a fost efectuată de ANOVA, analiza covarianței (ANCOVA) și măsuri repetate ANOVA, după caz. Tratamentele administrate și animalele individuale au fost incluse ca variabile independente în regresii. Gradul de libertate de eroare a fost numărul de nefroni mai mic decât gradele de libertate model. Acest lucru este mai riguros decât ceea ce se face de obicei cu datele de micropunctură, care este de a atribui un grad de libertate fiecărui nefron și de a ignora posibila influență a eterogenității între animale. În cazul de față, ANOVA a confirmat absența efectelor între animale în ambele seturi de experimente, astfel încât același rezultat statistic ar fi putut fi obținut ignorând efectul animal. Analiza a fost efectuată utilizând software proprietar (Systat, Evanston, IL).

Efectele LNMMA asupra SNGFR și a răspunsului TGF.

Seria LNMMA a inclus 210 colecții de fluide tubulare proximale târzii de la șase animale STN HS și șase animale HS simulate. Toate animalele au fost hrănite cu o dietă HS din prima zi postoperatorie. Micropunctura s-a făcut în postoperator zilele 8-10. Polii rinichiului infarctați anterior au fost scarificați. Suprafața porțiunii neinfarctate a apărut sănătoasă, cu tuburi mărite și turgor bun pentru a facilita micropunctura. Histologia în acest stadiu al STN prezintă hipertrofie și hiperplazie tubulară și glomeruloscleroză ușoară (11).

Datele SNGFR sunt prezentate în Tabelul 1 și Fig. 1. Răspunsurile TGF au fost relativ omogene între animalele din fiecare grup (P = 0,87 din testarea ANOVA pentru diferența dintre animale în răspunsul TGF). În timpul stimulului TGF minim, SNGFR nu a fost semnificativ diferit între STN HS și Sham HS. În timpul stimulului TGF maxim, SNGFR a fost de două ori mai mare în STN HS decât în ​​HS simulat (P

Tabelul 1. Rezultatele SNGFR pentru experimentele LNMMA

Valorile sunt exprimate ca medii ± SE. (+) și (-) se referă la stimulul TGF maxim și minim. Avg- SNGFR la mijlocul punctului TGF. Răspuns TGF - schimbare în SNGFR atunci când stimulul TGF s-a redus de la maxim la minim.

* P = 0,054 pentru răspunsul mediu TGF fiind negativ cu o coadă t-Test.

† P = 0,0007 pentru efectul LNMMA în STN HS de către Student’s t-Test.

oxidul

FIG. 1.Graficele liniare prezintă răspunsuri de feedback tubuloglomerular (TGF) pentru nefroni individuali atunci când bucla Henle este perfuzată cu sau fără LNMMA. TGF (+) denotă stimul maxim TGF. TGF (-) denotă un stimul minim al TGF. Graficele casetei Tukey arată cum se distribuie răspunsurile TGF în cadrul fiecărui grup. Modificarea ratei de filtrare glomerulară cu un singur nefron (ΔSNGFR) este diferența în SNGFR între TGF (-) și TGF (+). Un răspuns TGF este anormal dacă ΔSNGFR

Efectele benzamilului asupra SNGFR și a răspunsului TGF.

Seria benzamil a inclus 132 de colecții de fluide tubulare proximale târzii de la patru animale STN HS și patru animale Sham HS (patru colecții pe nefron). Datele SNGFR sunt prezentate în Tabelul 2 și Fig. 2. O matrice de corelație Pearson pentru cele patru măsurători SNGFR în cadrul fiecărui nefron este prezentată în tabelul 3. Efectele benzamilului asupra SNGFR nu au fost diferite între animale (P = 0,99 și P = 0,97 pentru eterogenitatea între animale în STN HS sau Sham HS). Cele patru colecții pe nefron din aceste experimente au inclus răspunsuri TGF înainte și în timpul benzamilului în fiecare nefron pentru a optimiza puterea statistică pentru a detecta efectele benzamilului prin asociere. ANOVA bidirecțional cu design pentru măsuri repetate a fost făcut pentru a testa efectele asupra răspunsului TGF al STN HS față de Sham HS (porțiunea ANOVA între subiecți) și pentru efectele benzamilului (porțiunea ANOVA din cadrul subiectului). Efectul între subiecți al STN HS a confirmat că TGF a fost suprimat sau paradoxal în STN HS în raport cu Sham HS (P = 0,002). Pentru porțiunea subiecților din ANOVA, nu a existat niciun efect semnificativ al benzamilului asupra răspunsului global TGF (P = 0,3) și niciun efect semnificativ al benzamilului asupra diferenței în răspunsul TGF între STN HS și Sham HS (P = 0,4).

Tabelul 2. Rezultatele SNGFR pentru experimentele cu benzamil

Valorile sunt exprimate ca medii ± SE. (+) și (-) se referă la stimulul TGF maxim și minim. Avg- SNGFR la punctul mediu TGF. Răspuns TGF - schimbare în SNGFR atunci când stimulul TGF s-a schimbat de la maxim la minim.

FIG. 2.Graficele liniare descriu modificările ratei de filtrare glomerulară cu un singur nefron (SNGFR) pentru nefroni individuali. A: SNGFR în timpul stimulării maxime (+) sau minime (-) a feedback-ului tubuloglomerular (TGF) utilizând fluid tubular artificial (ATF) sau ATF care conține benzamil. B: Răspunsuri TGF (ΔSNGFR) la perfuzarea buclei Henle cu controlul ATF sau ATF + benzamil. C: medie ± SE pentru ΔSNGFR. Efectul benzamilului nu a fost semnificativ statistic între grupuri sau în cadrul grupurilor.

Tabelul 3. Matricea de corelație Pearson pentru SNGFR în datele cumulate din experimentele cu benzamil: valori r

Răspunsurile TGF au fost corelate în cadrul grupurilor (r = 0,45).

Efectele STN asupra reabsorbției proximale.

Datele auxiliare privind reabsorbția proximală netă (Jprox) și reabsorbția fracțională proximală (FRprox) au fost obținute în cursul măsurării răspunsului TGF prin înregistrarea volumului împreună cu clearance-ul 3 H-inulină în fiecare colecție de lichid tubular proximal târziu. Testarea efectelor directe ale STN asupra Jprox și FRprox s-a făcut prin analiza covarianței cu STN ca factor și SNGFR ca covariați. Analiza covarianței produce valori pentru Jprox și FRprox care sunt ajustate pentru diferențe în SNGFR. Principalele rezultate sunt raportate ca efecte ale STN asupra Jproxь și FRproxь, care sunt valorile medii ale grupului respectiv după ajustarea pentru SNGFR.

Atât pentru seria de experimente LNMMA, cât și pentru benzamil, Jprox și FRprox au fost mai puține în STN HS față de Sham HS (P 5%.

Tabelul 4. Tabelul ANOVA pentru efectele STN și NaCl dietetice asupra reabsorbției proximale

Valorile sunt exprimate ca medii ± SE. Datele sunt acumulate din studiul actual și din experimentele publicate anterior (13). Jproxь- reabsorbție proximală netă ajustată pentru SNGFR de ANCOVA cu cele mai mici pătrate. FRprox- reabsorbție proximală fracționată ajustată pentru SNGFR de cel puțin pătrate ANCOVA. SNGFR a fost un determinant pozitiv al Jprox (P −4). SNGFR a fost un factor determinant negativ al FRprox (P −4).

FIG. 3.Măsura brută neajustată a reabsorbției proximale nete (Jprox) prezentată pentru fiecare dintre cele 667 de colecții de fluide tubulare proximale tardive grupate din experimentele curente și din experimentele publicate anterior în acest model (13) SNGFR, rata de filtrare glomerulară cu un singur nefron. Liniile descriu rezultatele regresiei liniare cu intervale de încredere de 95%.


FIG. 4.Măsura brută neajustată a reabsorbției fracționale proximale (FRprox) prezentată pentru fiecare dintre cele 667 de colecții de fluide tubulare proximale târzii reunite din experimentele curente și experimentele publicate anterior în acest model (13). Liniile arată rezultate ale regresiei liniare cu intervale de încredere de 95%. FRprox variază reciproc cu rata de filtrare glomerulară cu un singur nefron (SNGFR), ceea ce poate face din FRProx brut un indicator înșelător al efectului primar asupra tubului. Pante de regresie sunt mai puțin profunde în nefrectomia subtotală, care nu reușește să monteze FRprox ridicat la SNGFR scăzut. HS, sare mare; LS, sare mică.

Scopul principal al acestor experimente a fost de a determina mecanismul răspunsurilor anormale TGF apărute la șobolanii STN hrăniți cu o dietă HS cu noi date de micropunctură generate în acest scop. Un obiectiv secundar a fost de a examina rolul reabsorbției proximale în homeostazia NaCl prin combinarea datelor de micropunctură noi și vechi.

Am raportat anterior că răspunsul TGF este mai eterogen la nefronii de la șobolani STN decât la controalele acționate în mod fals atunci când ambii sunt hrăniți cu o dietă standard de laborator (12). Apoi am arătat că răspunsul TGF ar putea fi normalizat prin hrănirea unei diete cu conținut scăzut de NaCl (LS), dar a trecut de la a fi mai eterogen la a deveni franc paradoxal atunci când șobolanii STN au fost hrăniți cu o dietă bogată în NaCl (13). Cu alte cuvinte, hrănirea unei diete bogate în NaCl la un șobolan STN a schimbat câștigul răspunsului său TGF de la negativ la pozitiv. Un efect al TGF paradoxal va fi îndepărtarea unei frâne pe care TGF normal o pune pe creșterea livrării distale și facilitarea excreției de NaCl. Feedback-ul pozitiv mărește impactul unei perturbări exterioare și, prin urmare, este inerent destabilizator față de orice variabilă pe care o afectează. Deci, un alt efect al TGF paradoxal ar fi acela de a face funcția nefronică mai variabilă. Trecerea la TGF paradoxal în STN HS poate fi privită ca un mecanism prin care rinichiul STN este dispus să accepte o scădere a stabilității funcționale pentru a excreta o cantitate mare de NaCl per nefron, după cum este necesar pentru a atinge echilibrul NaCl. Rinichiul normal, cu 6 ori mai multe nefroni, poate atinge echilibrul în dieta HS cu TGF intact.

Prezentul studiu a fost întreprins pentru a examina două mecanisme posibile, prin care o dietă bogată în sare transformă sistemul TGF de la feedback negativ la feedback pozitiv. Strategia a fost de a vedea dacă diferența în răspunsul TGF între Sham și STN va dispărea dacă oricare dintre aceste mecanisme ar fi blocat. Pentru a atinge acest obiectiv, a trebuit doar să studiem șobolanii cu o dietă bogată în NaCl. Prin urmare, toate animalele din aceste studii au fost hrănite cu NaCl ridicat.

Descoperirile noastre indică faptul că o parte, sau toate, din transformarea în TGF cauzată de HS în rinichiul STN este mediată de un grup de oxid nitric care poate fi eliminat prin perfuzarea buclei Henle cu un blocant NOS. Pe baza a ceea ce se știe despre oxidul nitric în rinichi, este probabil ca acest fond de oxid nitric să fie format de NOS 1 în macula densa (9, 14). Între timp, constatările noastre indică faptul că niciunul dintre impactul HS asupra TGF nu poate fi atribuit cTGF, așa cum este descris în literatura recentă.

În prezent, am arătat că perfuzarea buclei Henle cu un inhibitor al oxidului nitric sintază normalizează răspunsul TGF în STN HS, fără a afecta TGF în Sham HS. Acest lucru este în concordanță cu teoria conform căreia rinichiul rămase folosește oxid nitric pentru a suprima TGF, ceea ce permite o livrare crescută de NaCl distal atunci când este provocat cu o dietă bogată în sare. Aceste date implică, de asemenea, că rinichiul rămas nu elimină TGF prin suprimarea semnalizării adenozinei A1R, deoarece blocarea NOS nu ar normaliza răspunsul vasoconstrictor TGF dacă ar fi cazul.

Există rapoarte recente că cTGF este un alt contra-regulator față de TGF tradițional. cTGF se crede că este mediat de vasodilatatoarele de prostaglandine formate ca răspuns la absorbția Na prin ENaC în tubul de legătură (6). Conform acestei teorii, ar trebui să fie posibil să se obțină un răspuns paradoxal TGF prin creșterea câștigului căii cTGF în raport cu calea tradițională a adenozinei A1R pentru TGF. Dacă cTGF explică efectul HS asupra răspunsului TGF în STN, atunci blocarea ENaC cu benzamil în STN HS ar trebui să normalizeze răspunsul TGF. În prezentele experimente am perfuzat nefronii cu benzamil, așa cum este descris în literatură (20, 21). Nu am observat niciun efect al benzamilului asupra răspunsului TGF în STN HS și am observat o tendință nesemnificativă pentru benzamil de a suprima răspunsul TGF în Sham HS, ceea ce este opus celor descrise în literatura de specialitate pentru cTGF (5-8, 20, 21).

Răspunsurile TGF pe care le-am obținut la animale operate de Sham în aceste studii sunt tipice pentru ceea ce este raportat pentru șobolanii normali în toată literatura (revizuit în Ref. 9). Răspunsurile TGF în STN HS nu au fost măsurate de alții (de care suntem conștienți). Acum am repetat aceleași experimente măsurând răspunsul TGF în STN HS la trei seturi de animale în ultimii șase ani, inclusiv un set care a fost publicat anterior (13). Compararea răspunsurilor TGF între aceste trei serii experimentale de către ANOVA întărește impresia că TGF este paradoxal în STN HS (răspuns TGF = - 4,9 ± 1,6 nl/min, P = 0,006, n = 68 nefroni) și nu diferă semnificativ între cele trei serii experimentaleP = 0,6 pentru eterogenitate între seriile de experimente).

rezumat.

Când șobolanii sunt hrăniți cu o dietă HS după nefrectomie subtotală, răspunsurile TGF devin anormale, astfel încât creșterea livrării de lichid și NaCl către macula densa face ca SNGFR să crească, mai degrabă decât să scadă. TGF anormal va facilita excreția excesului de NaCl, dar se așteaptă, de asemenea, să destabilizeze funcția nefronică. S-ar putea spune că o dietă bogată în NaCl stresează sever rinichiul STN până la punctul în care își compromite propria stabilitate pentru a atinge echilibrul de sare. Acest TGF anormal rezultă dintr-un răspuns exagerat de oxid nitric la livrarea macula densa, care este capabil să copleșească răspunsul obișnuit TGF. Nu a fost detectat niciun rol pentru cTGF. Ca rezultat secundar, aceste date de micropunctură au fost combinate cu date anterioare pentru a forma un set mare de date

700 de colecții de lichide tubulare cu putere statistică pentru a confirma că NaCl din dietă invocă o scădere majoră a reabsorbției în tubul proximal STN, care are capacitate limitată de a crește reabsorbția fracționată la debite scăzute .

Această cercetare a fost susținută de Departamentul pentru Afaceri al Veteranilor și Universitatea din Alabama din Birmingham/Universitatea din California la San Diego O'Brien Center for Acute Kidney Injury Research Grant P30-DK-079337.