M.W. Roomi, dr.,
B. Bhanap M.D.,
Dr. A. Niedzwiecki și M. Rath, M.D.
Dr. Rath Research Institute, CA, SUA

Dr. Aleksandra Niedzwiecki
Dr. Rath Research Institute, 1260 Memorex Drive, Santa Clara, CA 95050, SUA
E-mail: [email protected]

Abstract

Condrosarcomul, o tumoare malignă de origine cartilaginoasă, este cel mai frecvent dintre cancerele osoase primare la adulți. Patruzeci la sută din cancerele osoase primare sunt condrosarcom. Cu toate acestea, deoarece condrosarcomul nu răspunde de obicei la radiații și chimioterapie, intervenția chirurgicală este principala opțiune de tratament. Mortalitatea prin cancer rezultă de obicei din metastaze locale și îndepărtate. Pe baza prognosticului slab al condrosarcomului, am investigat efectele unui amestec de fitonutrienți (PB) care conține quercetină, Cruciferex ™, curcumină, resveratrol și extract de ceai verde pe mai mulți parametri asociați cu dezvoltarea acestui tip de cancer.

Celulele condrosarcomului SW-1353 expuse la concentrații de PB de 10, 25, 50 și 100 pg/ml au fost testate pentru proliferarea/viabilitatea celulară, morfologia, secreția de matrice metaloproteinază (MMP), precum și abilitățile lor invazive și de migrare. Proliferarea celulară a fost realizată prin testul MTT, secreția MMP-urilor prin zimografie, invazia celulară prin testul Matrigel, migrația celulară prin testul zgârieturilor și morfologia prin colorarea H&E. PB a inhibat proliferarea celulară într-o manieră dependentă de doză începând cu concentrația de 25 ug/ml. Zimografia a demonstrat două benzi corespunzătoare MMP-2 și MMP-9 cu o expresie îmbunătățită a MMP-9 la tratamentul cu PMA. PB a inhibat expresia ambelor MMP într-o manieră dependentă de doză atât în ​​celulele stimulate de PMA, cât și în celulele non-stimulate. Invazia Matrigel a fost total blocată la 25µg/ml. Colorarea H&E a arătat că amestecul de PB la 25 ug/ml până la 100 ug/ml a indus modificări apoptotice în celulele SW-1353. Inhibarea semnificativă a semnelor importante ale progresiei cancerului de către amestecul PB sugerează că această compoziție nutritivă ar trebui explorată în continuare ca agent terapeutic în condrosarcom.

Text complet

Euntroducere

Condrosarcomul, o tumoare malignă a celulelor cartilajului, afectează în principal adulții cu vârsta cuprinsă între 30 și 60 de ani. Conform estimărilor Societății Americane de Cancer, condrosarcomul a devenit cel mai frecvent cancer primar osos, reprezentând mai mult de 40% din cazurile de tumori osoase primare la adulți 1. Se dezvoltă în condrocite sau celule cartilaginoase și afectează în principal picioarele, brațele superioare, scapula, coastele și oasele pelvine. Deși etiologia exactă a condrosarcomului nu este cunoscută, se postulează că indivizii cu anumite anomalii genetice sau cromozomiale prezintă un risc crescut. Gradul și stadiul sunt cei mai importanți și independenți factori de prognostic pentru supraviețuirea în condrosarcom. Mortalitatea prin cancer rezultă de obicei din invazia tumorii și metastazele locale sau la distanță la organele vitale. Condrosarcomul de grad înalt are un prognostic mult mai slab, cu un procent calculat de 38% dintre pacienți care au atins supraviețuirea de 10 ani Recurența se bazează pe margini tumorale neregulate și leziuni mai mari de 10 cm.

Chirurgia este, în general, principala opțiune de tratament pentru condrosarcom, deoarece chimioterapia sau radioterapia nu sunt foarte eficiente și sunt rareori administrate în cazurile de metastaze extinse 3. Potențialul metastatic ridicat și rezultatele slabe asociate cu terapiile actuale necesită dezvoltarea unor alternative de tratament mai eficiente și mai puțin toxice.

Folosirea produselor naturale de sănătate pentru prevenirea, inhibarea și inversarea carcinogenezei a câștigat popularitate, deoarece dovezile științifice au demonstrat că consumul ridicat de fructe și legume este asociat cu un risc redus de diferite tipuri de cancer 4, 5. S-a raportat că diferiți polifenoli obținuți din plante oferă o gamă largă de proprietăți anticancerigene, cum ar fi modularea proliferării celulare, creșterea tumorii, angiogeneza, metastazele, în amonație și inducerea apoptozei. Cu toate acestea, majoritatea studiilor au fost efectuate cu polifenoli individuali, dintre care mulți au o biodisponibilitate slabă.

În studiul nostru, am folosit o combinație de mai mulți polifenoli pentru a obține efecte pleiotrope împotriva celulelor condrosarcom și pentru a modula biodisponibilitatea acestor compuși naturali prin interacțiunile lor. Potențialul anti-cancer al unui amestec de fitobiologice (PB) care conține quercetină, curcumină, ceai verde, cruciferex ™ și resveratrol a fost testat în celulele condrosarcomului uman SW-1353 prin evaluarea viabilității celulare, secreția MMP, invazia celulară, migrația și morfologia.

Metode și materiale

Liniile celulare canceroase și cultura

Linia de celule condrosarcom SW-1353 a provenit din American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) și a crescut în mediu modificat Dulbecco's Eagle suplimentat cu 10% ser fetal bovin, 100 U/ml penicilină și 100 μg/ml streptomicină (Gibco BRL, Long Island, NY) în plăci de cultură tisulară cu 24 de godeuri (Costar, Cambridge, MA). Celulele au fost incubate în 1 ml mediu la 37 ° C într-un incubator de culturi de țesut echilibrat cu 95% aer și 5% CO2. La aproape conflux, celulele au fost tratate cu PB dizolvat în mediu și testate în triplicat: 0, 10, 25, 50, 100 pg/ml. Celulele au fost, de asemenea, tratate cu acetat de mirorat de Phorbol (PMA) 100 ng/ml pentru a spori expresia MMP-9. Plăcile au fost apoi returnate la incubator.

Compoziția amestecului de fitonutrienți

Amestecul de substanțe nutritive (PB) a fost compus din următoarele cantități indicate: quercetin 400 mg; CruciferexTM 400 mg; curcumină 300 mg; resveratrol 50 mg și extract standardizat de frunze de ceai verde 300 mg, obținut de la US Pharma Lab. Certificatul de analiză a indicat următoarele caracteristici ale extractului de ceai verde: polifenol total 80%, catehine 60%, epigalocatechină galat (EGCG) 35% și cofeină 1,0%.

Testul MTT

Viabilitatea celulară a fost evaluată prin testul MTT, un test colorimetric bazat pe capacitatea celulelor viabile de a reduce o sare solubilă de tetrazoliu galben [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-difenil tetrazoliu bromură] (MTT) la un cristal albastru de formazan prin activitatea succinatului dehidrogenazei mitocondriale a celulelor viabile. Acest test este un bun indice de activitate mitocondrială și, prin urmare, de viabilitate celulară. După 24 de ore de incubație, celulele au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și 500 pl de MTT (Sigma # M-2128); La fiecare godeu s-au adăugat 0,5 mg/ml în mediu. După adăugarea MTT (0,5 mg/ml) plăcile au fost acoperite și returnate la incubatorul la 37 o C timp de 2 ore, timpul optim pentru formarea produsului formazan. După incubare, supernatantul a fost îndepărtat cu grijă din godeuri, produsul formazan a fost dizolvat în 1 ml dimetil sulfoxid (DMSO) și absorbanța a fost măsurată la 570 nm în spectrometrul Bio Spec 1601, Shimadzu. OD570 al soluției DMSO din fiecare godeu a fost considerat a fi proporțional cu numărul de celule. OD570 al controlului (tratament fără supliment) a fost considerat 100%.

Gelatinaza Zimografie

Zimografia cu gelatinază a fost efectuată în gel de poliacrilamidă SDS 10% Novex Pre-Cast (Invitrogen Corporation) în prezența 0,1% gelatină în condiții nereducătoare. Mediile de cultură (20 pl) au fost amestecate cu tampon de probă și încărcate pentru SDS-PAGE cu tampon SDS tris-glicină, așa cum sugerează producătorul (Novex). Probele nu au fost fierte înainte de electroforeză. După electroforeză, gelurile au fost spălate de două ori în 2,5% Triton X-100 timp de 30 de minute la temperatura camerei pentru a îndepărta SDS. Gelurile au fost apoi incubate la 37 o C peste noapte într-un tampon substrat conținând 50mM Tris-HCI și 10mM CaCl2 la pH 8,0 și colorate cu 0,5% Coomassie Blue R250 în 50% metanol și 10% acid acetic glacial timp de 30 de minute și destinate. La renaturarea enzimei, gelatinazele au digerat gelatina în gel, producând benzi clare pe un fundal intens colorat. Standardele de proteine ​​au fost executate concomitent și greutățile moleculare aproximative au fost determinate prin reprezentarea grafică a mobilităților relative ale proteinelor cunoscute.

Invazia Matrigel
Studiile de invazie au fost efectuate folosind inserții Matrigel (Becton Dickinson) în plăci cu 24 de godeuri. Suspendate în mediu, SW-1353 au fost suplimentate cu fitonutrienți, așa cum se specifică în proiectul experimentului și s-au însămânțat pe inserția din godeu. Plăcile cu inserțiile au fost apoi incubate într-un incubator de cultură echilibrat cu 95% aer și 5% CO2 timp de 24 de ore. După incubare, mediile din fântâni au fost retrase. Celulele de pe suprafața superioară a inserțiilor au fost spălate ușor cu tampoane de bumbac. Celulele care au pătruns în membrana Matrigel și au migrat pe suprafața inferioară a Matrigel au fost colorate cu hematoxilină și eozină și numărate vizual la microscop.

Test de zgârieturi
O singură zgârietură neîntreruptă cu lățimea de 2 mm a fost făcută pe plăcile de cultură ale celulelor condrosarcom SW-1353 crescute până la confluență. Plăcile de cultură au fost spălate cu PBS și incubate cu PB în mediu testat la 0, 10, 25, 50 și 100 μg/ml în triplicat la fiecare doză timp de 24 de ore. Celulele au fost spălate, fixate și colorate cu H&E și s-au luat fotomicografii.

Morfologie: colorare H&E
Morfologia celulelor cultivate timp de 24 de ore în concentrațiile testate de PB au fost evaluate prin colorare H&E și observate și fotografiate prin microscopie.

Analize statistice
Rezultatele au fost exprimate ca medii +/- SD, așa cum este indicat în rezultate, pentru grupuri. Datele au fost analizate prin eșantion independent de test „t” utilizând software-ul MedCalc (Markakerke, Belgia).

Rezultate

Proliferarea/viabilitatea celulară
PB a inhibat semnificativ proliferarea celulelor SW-1353 de condrosarcom într-o manieră dependentă de doză, cu 16,8% inhibare la 10 μg/ml, 30% la 25 μg/ml, 53% la 50 și 66% la concentrația de 100 μg/ml, după cum se arată în Figura 1.

specific

Figura 1A - Efectul PB asupra creșterii celulelor condrosarcomului SW 1353: test MTT 24h

Zimografia gelatinazei
Așa cum se arată în Figura 2, zimografia a indicat prezența MMP-2 și MMP-9 în celulele condrosarcomului SW-1353 cu inducție puternică a MMP-9 prin expunerea celulelor la PMA. MMP-2 și MMP-9 au fost inhibate de PB într-o manieră dependentă de doză atât în ​​celulele SW-1353 stimulate de PMA, cât și în cele nestimulate. Secreția MMP-2 a fost deja blocată semnificativ la o concentrație de PB de 25 ug/ml.

Figura 2 - Efectul PB asupra MMP-2 și -9 în celulele condrosarcomului SW 1353: zimografie cu gelatinază (Legendă: 1-Markere, 2- Control, 3-6 PB 10, 25, 50, 100 μg/ml)

Invazia Matrigel
PB a inhibat invadarea celulelor condrosarcomului SW-1353 prin Matrigel cu 84% la concentrația de 10 μg/ml, cu o inhibare virtuală de 100% la 25 µg/ml, așa cum se arată în Figura 3.

Figura 3 - Efectul PB asupra invaziei Matrigel a celulelor condrosarcom SW 1353

Test de zgârieturi
Figurile 4A până la 4G arată că PB a redus migrația celulară a celulelor condrosarcom SW-1353 într-o manieră de răspuns la doză, cu o inhibare completă a migrării celulare la 50 µg/ml.

Figura 4 - Efectul PB asupra migrației celulelor condrosarcom SW 1353 prin test zgâriet: 4 A-Control, 4B-Just scartched, 4C- 24 ore după zero, 4D-PB 10ugml, 4E- PB 25 μg/ml, 4F-PB 50 μg/ml, 4G-PB 100 μg/ml.

Morfologie: colorare H&E
Colorarea H&E a arătat modificări apoptotice în creștere progresivă în celulele condrosarcomului expuse la PB începând de la 25 µg/ml până la 100 µg/ml așa cum se vede în figurile 5A până la 5E.

Figura 5 - Efectul PB asupra morfologiei celulelor SW 1353 de condrosarcom: colorare H&E

Discuţie

Pe baza opțiunilor de tratament disponibile, prognosticul condrosarcomului este încă slab. Prin urmare, în căutarea unei abordări eficiente am investigat eficacitatea celulară a unui amestec specific de polifenoli diferiți (PB) pentru efectele lor pleiotropice anticanceroase utilizând linia celulară de condrosarcom SW-1353.

Rezultatele noastre demonstrează că PB este eficient în inhibarea mai multor mecanisme cheie ale cancerului, inclusiv proliferarea celulară (inhibare de până la 70% la o concentrație de 100 μg/ml) și declanșarea apoptozei. În plus, folosind testul de zgârieturi pe gel și testele de invazie Matrigel, am observat o scădere dependentă de doză a secreției de MMP asociate în mare măsură cu agresivitatea cancerului, cum ar fi MMP2 și MMP9, și inhibarea migrației celulare. Aceste etape critice în invazia și metastaza cancerului au fost blocate de PB.

În special, degradarea enzimatică a ECM este esențială în facilitarea creșterii tumorii, invaziei, angiogenezei și metastazelor și controlul acesteia este un pas important în oprirea progresiei tumorii. Metaloproteinazele matriciale (MMP) sunt o familie de enzime proteolitice care degradează țesutul conjunctiv și în special MMP-2 și MMP-9 au fost asociate cu metastaze canceroase și angiogeneză tumorală 6, 7. Aceste două enzime joacă un rol cheie în degradarea tipurilor de colagen I și IV, componente importante ale ECM și membranelor de bază 8. Exprimarea îmbunătățită a enzimelor MMP a fost asociată cu potențialul malign al condrosarcoamelor 8. Studiile noastre au demonstrat că expunerea celulelor la PB are ca rezultat o inhibare semnificativă a expresiei MMP-2 și MMP-9 atât în ​​celulele condrosarcomului nestimulate, cât și în cele stimulate de PMA.

Am aplicat o combinație a acestor compuși naturali pentru a le crește potențialul celular anticancer și pentru a le modula biodisponibilitatea. Ca atare, studii anterioare au arătat că quercetina poate crește eficacitatea biologică a ceaiului verde, a curcuminei și a resveratrolului 20, 21, 22. În plus, efectele lor sinergice și aditive ar putea permite extinderea mecanismelor anti-cancer și, ca atare, ar putea crește eficacitatea generală împotriva cancerului 23. Am demonstrat mai devreme că acești micronutrienți au afectat semnificativ mecanismele anticanceroase din alte tipuri de celule canceroase, sugerând efectele lor universale, dar nu specifice cancerului, 24, 25 .

Concluzie

Studiile noastre au demonstrat că un amestec de componente fitobiologice naturale specifice (PB) ar putea inhiba semnificativ mecanismele cheie ale cancerului în celulele condrosarcomului, cum ar fi potențialul lor invaziv, proliferarea celulară, secreția de MMP-2 și -9, pe lângă efectele pro-apoptotice. Aceste constatări sugerează că PB ar trebui investigat în continuare ca măsură de prevenire eficientă și sigură și tratament împotriva condrosarcomului.

Mulțumirints

Studiul de cercetare a fost finanțat de Dr. Rath Health Foundation (Santa Clara, CA), o organizație non-profit. Mulțumim dnei Cathy Flowers și Elizabeth Wells pentru asistență la corectură.