Ramadass Balamurugan

The Wellcome Trust Laboratory Research, Department of Gastrointestinal Sciences, Christian Medical College, Vellore, India

potențialul

Aarthi Sophia Chandragunasekaran

The Wellcome Trust Laboratory Research, Department of Gastrointestinal Sciences, Christian Medical College, Vellore, India

Gowri Chellappan

The Wellcome Trust Laboratory Research, Department of Gastrointestinal Sciences, Christian Medical College, Vellore, India

Krithika Rajaram

The Wellcome Trust Laboratory Research, Department of Gastrointestinal Sciences, Christian Medical College, Vellore, India

Gayathri Ramamoorthi

The Wellcome Trust Laboratory Research, Department of Gastrointestinal Sciences, Christian Medical College, Vellore, India

Balakrishnan S. Ramakrishna

The Wellcome Trust Laboratory Research, Department of Gastrointestinal Sciences, Christian Medical College, Vellore, India

Abstract

Context și obiective:

Microbiota intestinului uman joacă un rol semnificativ în procesele nutriționale. Conceptul de probiotice a condus la un consum larg de preparate alimentare care conțin microbi probiotici precum caș și iaurt. Cașul preparat acasă este consumat în fiecare zi în majoritatea caselor din sudul Indiei. În acest studiu, cașul de casă a fost evaluat pentru bacteriile lactice (LAB) cu potențial probiotic.

Metode:

Cincisprezece LAB (12 lactobacili, 1 Lactococcus, 2 Leuconostoc) și o drojdie izolată din caș de casă au fost evaluate pentru rezistența la acid, pepsină, pancreatină și săruri biliare; rezistență antimicrobiană; activitate antimicrobiană intrinsecă; aderarea la celulele epiteliale Caco-2; capacitatea de a bloca aderența agentului patogen la celulele Caco-2; capacitatea de a inhiba secreția de interleukină (IL) -8 din celulele epiteliale HT-29 ca răspuns la Vibrio cholerae; și capacitatea de a induce expresia anti-inflamatorie a citokinelor în celulele monocite THP-1.

Rezultate:

Abundența Lactobacillus în cașul de fermentare a atins un vârf puternic la 12 ore. Nouă dintre tulpini au supraviețuit expunerii la acid (pH 3,0) timp de cel puțin o oră și toate tulpinile au supraviețuit în prezența pancreatinei sau a sărurilor biliare timp de 3 ore. Niciunul nu a prezentat activitate hemolitică. Toți au fost rezistenți la majoritatea antimicrobienilor testați, dar au fost sensibili la imipenem. Majoritatea tulpinilor au inhibat creșterea Salmonella Typhimurium, în timp ce cinci au inhibat creșterea V. cholerae O139. Șapte tulpini au arătat aderența la celulele Caco-2 variind între 20-104% din aderența unei tulpini aderente de Escherichia coli, dar toate au inhibat aderența V. cholerae la celulele Caco-2 cu 20-100%. Au inhibat secreția de interleukină-8 din celulele HT-29, ca răspuns la V. cholerae, cu 50-80%. Două tulpini au indus expresia acidului ribonucleic mesager (mRNA) IL-10 și IL-12 în celulele THP-1.

Interpretare și concluzii:

LAB în caș a avut proprietăți în concordanță cu potențialul probiotic, dar acestea nu au fost consistente între specii. Abundența LAB în caș a crescut rapid la 12 ore de fermentare la temperatura camerei și a scăzut după aceea.

Alimentele fermentate care conțin LAB sunt utilizate în mod tradițional în fiecare zi ca alimente în multe culturi. Cașul, preparat prin fermentarea laptelui cu un inocul de caș făcut anterior, este utilizat în majoritatea gospodăriilor din sudul Indiei, unde constituie o parte semnificativă a dietei zilnice. Laboratoarele care fermentează laptele sunt susceptibile să difere ușor în fiecare gospodărie, deoarece nu există o cultură inițială standardizată utilizată pentru prepararea cașului. Deși se crede că cașul are proprietăți probiotice 9, 10, există puține documente în acest sens în literatura de specialitate. Prin urmare, acest studiu a fost întreprins pentru a evalua LAB din cașul de casă din sudul Indiei pentru proprietăți probiotice.

Material și metode

Tulpini bacteriene și sursă: izolate clinice ale unui Escherichia coli patogen, Vibrio cholerae O139, tulpina Salmonella Typhimurium și Shigella flexneri au fost donate cu amabilitate de către Departamentul de Microbiologie Clinică, Colegiul și Spitalul Medical Medical (CMCH), Vellore, Tamil Nadu, India.

Mediu de creștere: Vibrio a fost crescut în apă de peptonă alcalină, în timp ce tulpinile patogene rămase au fost crescute în bulion de infuzie cardiacă cerebrală (Hi-media, Mumbai, India) la 37 ° C. Numărul total viabil al izolatelor LAB a fost determinat folosind agar de Man Rogosa Sharpe (MRS) la 37 ° C. Shigella și Salmonella au fost enumerate pe agar Salmonella Shigella (SS) (Hi-media, Mumbai, India), E. coli pe agar MacConkey (Hi-media, Mumbai, India) și V. cholerae pe tiosulfat-citrat-săruri biliare-zaharoză Agar (TCBS) (Hi-media, Mumbai, India) după 18 ore la 37 ° C.

Izolarea LAB și identificarea lor de către API 50CH: Studiul a fost realizat în Departamentul de Științe Gastrointestinale, CMCH, Vellore, Tamil Nadu, India între 2008 și 2010. Probele de caș proaspăt obținute au fost obținute de la 16 gospodării pe o rază de 50 km de Vellore și transportat imediat la laborator. Gospodăriile alese aparțineau cercetătorilor de laborator care făceau caș în fiecare zi acasă folosind o porție mică de caș pentru a inocula laptele care apoi era lăsat acoperit peste noapte la temperatura camerei. Probele de caș au fost transportate la laborator dimineața și au fost plasate pe agar MRS și incubate peste noapte la 37 ° C. Coloniile microbiene care au crescut în cultură au fost identificate prin colorare Gram, test catalază și caracterizare biochimică 11. API 50 CH a fost utilizat împreună cu API 50 CHL (bioMerieux, Chennai, India) pentru identificarea LAB. Tulpinile identificate de sistemul API 50CH au fost supuse analizei curbei de creștere pentru a determina perioada de timp în care s-a observat creșterea exponențială. LAB au fost cultivate pe bulion Lactobacillus MRS (Himedia, Mumbai, India) timp de 16 ore la 37 ° C cu 10% CO2 în condiții anaerobe și utilizate pentru testare.

Cinetica de creștere a LAB: Profilul creșterii LAB în timpul formării cașului a fost explorat prin studii de timp care implică fermentarea în laborator a laptelui folosind caș ca cultură inițială. Inoculele de caș proaspăt au fost folosite pentru a însămânța trei (două pasteurizate, una nepasteurizată) 150 ml alicote de lapte la o concentrație de 1% (g/v). Laptele a fost lăsat să fermenteze 48 de ore la temperatura camerei și o alicotă de 1,5 ml a fost îndepărtată la fiecare 4 ore pentru cultură și pentru izolarea acidului dezoxiribonucleic (ADN). Probele au fost striate pe agar MRS, agar MacConkey și agar sânge. Plăcile de agar MRS au fost incubate timp de 24 de ore la 37 ° C în condiții anaerobe cu 10% CO2, în timp ce plăcile de agar MacConkey și agar de sânge au fost incubate timp de 48 de ore la 37 ° C. După incubație, coloniile au fost enumerate și s-au observat variații ale morfologiei coloniilor la diferite durate. ADN-ul a fost izolat din probele de caș 12 și a fost supus reacției în lanț a polimerazei în timp real (PCR) folosind primerii vizați la secvențele genei 16S ARNr specifice Lactobacillus genului 13, 14. Amplificarea secvențelor de lactobacili a fost exprimată în raport cu amplificarea secvențelor conservate pentru bacteriile din domeniu (universale).

Studii efectuate cu LAB: Următoarele experimente au fost efectuate atunci când tulpinile erau în faza staționară timpurie. Izolatele au fost selectate pentru atribute compatibile cu proprietățile probiotice. Acestea au inclus rezistență la acid și pepsină, toleranță la sare biliară și pancreatină, rezistență antimicrobiană, producție antimicrobiană intrinsecă, aderență la (și inhibarea aderenței agentului patogen la) celulele epiteliale intestinale Caco-2, modularea răspunsului IL-8 în epiteliul colonic HT-29 celulelor și modularea expresiei citokinelor în celulele monocite THP-1.

Toleranță la acid, pepsină, bilă și pancreatină și activitate hemolitică intrinsecă: Capacitatea organismelor de a supraviețui condițiilor adverse a fost evaluată prin incubarea organismelor în cultura de bulion MRS în prezența acestor influențe adverse și îndepărtarea alicotelor la momente specificate pentru placare pe Plăci de agar MRS pentru a constata creșterea. Capacitatea izolatelor de a supraviețui în prezența acidului clorhidric (pH 1,0 și pH 3,0), pepsină (3 mg/ml, pH 2,0), pancreatină (1 mg/ml, pH 8,0) și săruri biliare (0,3% gr/v Ox Gall) a fost măsurată. Reactivii pentru aceste teste au fost obținuți de la Sigma Chemical Co., SUA. Activitatea hemolitică intrinsecă a fost determinată de cultură pe plăcile de agar din sânge Columbia timp de 48 de ore și observând hemoliza în jurul coloniilor.

Sensibilitate și activitate antimicrobiană: Sensibilitatea antimicrobiană la ampicilină, co-amoxicil, gentamicină, cloramfenicol, rifampicină, norfloxacină, vancomicină și imipenem au fost determinate folosind metoda de difuzie a discului Kirby-Bauer 15 (Himedia, Mumbai, India) cu definiții standard pentru sensibilitatea la rezistență la antimic. 16. Discurile conțineau următoarele cantități pe disc (în µg): Ampicilină (10), co-amoxicilv (30), gentamicină (10). cloramfenicol (30), rifampicină (5), norfloxacină (10), vancomicină (30), imipenem (10), tetraciclină (30).

Activitatea antimicrobiană intrinsecă împotriva E. coli, S. Typhimurium, V. cholerae și S. flexneri a fost determinată prin difuzarea bine în plăcile de agar moale BHI și au fost măsurate zonele de inhibare.

Inhibarea aderenței agentului patogen: Capacitatea tulpinilor de a inhiba aderența agentului patogen la celulele Caco-2 a fost, de asemenea, testată in vitro 19. Pe scurt, monostraturile Caco-2 în plăci cu 24 de godeuri au fost suprapuse cu tulpinile testate timp de 90 de minute, după care bacteriile au fost îndepărtate și monostratul celular a fost spălat de trei ori cu DMEM. Un ml de DMEM conținând 10 8 V. cholerae sau celule S. Typhimurium a fost suprapus pe monostraturi, incubat timp de 90 de minute, și aderentul V. cholera sau S. Typhimurium enumerat folosind procedura descrisă mai sus.