Xin Yang

1 Școală de chimie și inginerie chimică, Universitatea Yantai, Yantai 264005, China

Di Zhang

2 Școala de farmacie, Universitatea Yantai, Yantai 264005, China

Li-min Song

1 Școală de chimie și inginerie chimică, Universitatea Yantai, Yantai 264005, China

Qian Xu

2 Școala de farmacie, Universitatea Yantai, Yantai 264005, China

Hong Li

2 Școala de farmacie, Universitatea Yantai, Yantai 264005, China

Hui Xu

2 Școala de farmacie, Universitatea Yantai, Yantai 264005, China

3 Laborator cheie de farmacologie moleculară și evaluare a medicamentelor, Universitatea Yantai, Yantai 264005, China

4 Centrul colaborativ de inovare a sistemului avansat de livrare a medicamentelor și a medicamentelor biotehnologice în universitățile din Shandong, Ministerul Educației, Yantai 264005, China

Abstract

1. Introducere

Bujora erbacee (Paeonia suffruticosa Andr.) Este un fel de plantă ornamentală tradițională chineză cultivată pe scară largă în China, America, Europa și alte zone asiatice. În plus față de utilizarea ornamentală pentru florile lor atractive, majoritatea speciilor de bujor au fost folosite și ca plante medicinale, iar studiile s-au concentrat în principal pe paeonol, paeoniflorină și alte componente bioactive în corola, frunze și scoarță de rădăcină pentru o lungă perioadă de timp [1-3]. Coaja de rădăcină uscată a bujorului, denumită mudanpi în chineză, a fost înregistrată oficial în toate edițiile farmacopeei chineze (ChP) și utilizată pe scară largă în preparatele compuse din medicina tradițională chineză pentru promovarea circulației sângelui și îndepărtarea stazei de sânge. Semințele de bujor sunt principalul produs secundar al mudanpi cu un randament mediu anual de până la 3750 kg pe hectar. Cu toate acestea, aproape toate semințele de bujor au fost luate doar ca deșeuri industriale. În ultimul deceniu, această resursă vegetală atrage mari interese pentru dezvoltarea ulterioară, deoarece semințele de bujor, în special uleiul de semințe, au fost găsite bogate în acizi grași nesaturați, aminoacizi, stilbenoizi și alți nutrienți [4, 5].

2. Materiale și metode

2.1. Materiale și produse chimice

Eșantionul testat de PSO a fost un produs de la Heze Ruipu Peony Technology Development Corporation (Shandong, China) preparat printr-o metodă tradițională de presare la rece. Uleiul de măsline extravirgin (EVOO, Olivoila®, Italia) folosit ca control a fost achiziționat de la un supermarket local. Pentru ambele probe de ulei, principalii indici chimici, inclusiv valoarea acidului, valoarea iodului, valoarea peroxidului și valoarea saponificării au fost detectați pentru a măsura cerințele standardului național chinez pentru uleiul vegetal comestibil. S-au obținut de la Sigma-Aldrich Co. acid galic, α-tocoferol, 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), reactiv Folin-Ciocalteu, carboximetilceluloză (CMC) sodică și albumină serică bovină (BSA). (St. Louis, MO, SUA). Acidul salvianolic A (SAA), un fel de compus polifenolic natural, cu proprietăți antioxidante puternice [16], a fost furnizat cu amabilitate de Shandong Target Drug Co. Ltd. (Yantai, China) și capsula Xuezhikang a fost produsul Universității Beijing Peking WBL Biological Technology Co. Ltd., China. Toate celelalte substanțe chimice au fost de cea mai înaltă calitate disponibilă.

2.2. Analiza acizilor grași și a problemelor insaponificabile

PSO (5 g) a fost hidrolizat cu 20 ml de KOH 2 M în metanol la 60 ° C timp de 30 min. Fracția nesaponificabilă a fost extrasă folosind metoda lui Wang și colab. [17]; între timp, fracțiunea saponificabilă a fost convertită în esteri metilici ai acizilor grași (FAME) și extrasă în hexan conform metodei Zhou și colab. [9]. Pentru ambele fracții, reziduurile au fost uscate sub vid și cântărite după îndepărtarea solvenților de extracție. Procentul de greutate al substanțelor nesaponificabile (rom) și al acizilor grași (Rfa) în PSO a fost calculat ca Wuf/Woil × 100% și (1 - Wuf/Woil) × 100%, respectiv, unde Wuf a însemnat greutatea fracției nesaponificabile și Woil greutatea PSO. Apoi ambele reziduuri au fost redizolvate în hexan și supuse analizei prin cromatografie de gaz-spectrometrie de masă (GC-MS) utilizând un sistem Shimadzu QP2010 Plus GC-MS (Kyoto, Japonia) în conformitate cu condițiile raportate anterior [9, 17]. Analiza calitativă a fost efectuată prin potrivirea modelelor de fragmentare a masei de vârf cu cele din bibliotecile de spectru de masă NIST05, iar analiza cantitativă a fost efectuată prin normalizarea zonelor de vârf pentru a obține conținutul procentual al fiecărei componente, Pep, din care rata sa în PSO (R) ar putea fi calculată prin înmulțirea cu Rum sau Rfa.

2.3. Testul total al tocoferolilor și al fenolicii totale

După extracție prin metoda lui Li și colab. [18], tocoferolii totali din PSO au fost testați utilizând un spectrofotometru de fluorescență Hitachi F7000 (Tokyo, Japonia) cu α-tocoferol ca referință. Lungimea de undă de 280 nm a fost utilizată pentru excitație și 324 nm pentru emisie. Fenolicii totali din PSO au fost extrasați cu metanol și apoi determinați utilizând reactivul Folin-Ciocalteu conform metodei Xie și colab. [19]. Acidul galic a fost utilizat ca standard de referință, iar rezultatele au fost exprimate ca echivalenți de acid galic (GAE) în PSO.

2.4. Determinarea activităților antioxidante in vitro

2.4.1. Test DPPH Scavenging

DPPH este un fel de radical liber stabil cu o bandă puternică de absorbție centrată la aproximativ 520 nm, ducând la o culoare violetă profundă a radicalului DPPH în soluție. Va deveni incolor sau galben pal atunci când este neutralizat, ceea ce permite monitorizarea concentrației radicale pentru a evalua activitatea de eliminare a radicalilor din schimbarea absorbției optice [20]. Activitatea de curățare în ceea ce privește radicalii liberi DPPH a fost determinată printr-o metodă descrisă de Wang și colab. [21] cu ușoare modificări. Pe scurt, 4,6 ml alicote de probe testate dizolvate în DMSO la concentrații de 0-50 mg · mL -1 au fost amestecate cu 0,4 ml soluție etanolică proaspătă de DPPH (1 mM) și apoi lăsate să stea la temperatura camerei timp de 30 min. În același timp, amestecul fără probă de testare a fost preparat ca martor martor. Apoi absorbanța a fost măsurată la 517 nm folosind un spectrofotometru Shimadzu UV2550 (Kyoto, Japonia). Procentul de activitate de eliminare a DPPH exprimat ca% eliminare a fost calculat prin ecuația (1 - AA/AB) × 100%, în care AA și AB au fost valorile absorbantei probei de testare și, respectiv, golul.

2.4.2. Test hidroxil de eliminare radicală

Pentru ambele modele, EVOO și α-tocoferolul au fost utilizate ca martori pozitivi, iar concentrația pentru 50% din efectul maxim de eliminare, EC50, a fost calculată pentru comparație cantitativă.

2.5. Determinarea activităților antioxidante in vivo

2.5.1. Experimentare pe animale

Activitățile antioxidante in vivo au fost investigate folosind modelul șoarecelui de leziuni hepatice acute induse de șobolani CCl4 și hiperlipidemie induse de o dietă bogată în grăsimi conform metodelor raportate anterior cu unele modificări [15, 23]. Animalele, inclusiv șoarecii adulți Kunming masculi sănătoși și șobolanii Sprague-Dawley (SD), au fost furnizați de Centrul Experimental pentru Animale din Shandong Luye Pharmaceutical Co. Ltd. (Yantai, China), găzduit sub un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore într-o unitate de animale aprobată menținută la 22 ± 2 ° C și 40% până la 60% umiditate relativă, având acces ad libitum la alimente și apă și permisă se aclimatizează timp de o săptămână înainte de experimentare. Toate protocoalele și experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul pentru etica experimentelor pe animale de la Universitatea Yantai și au respectat ghidurile Institutelor naționale de sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator.

Optzeci de șoareci cu greutatea de 20 ± 2 g au fost alocați aleatoriu în șase grupe pentru un experiment consecutiv de 4 săptămâni, inclusiv grupul de control normal (NC, n = 8), grupul de control model (MC, n = 8), grupul de control pozitiv (MC + P, n = 16) și dozele mici, medii și mari ale grupurilor tratate cu PSO (MC + L, MC + M și MC + H; n = 16 pentru fiecare grup). Șoarecii din grupurile MC + P, MC + L, MC + M și MC + H au fost administrați o dată pe zi prin gavaj oral cu SAA (7,5 g · kg -1 -1 d -1) și PSO (1,3, 4,0 sau 12,0 g · kg −1 d −1) suspendate în 1% Na-CMC și cele din grupele NC și MC cu volum echivalent de agent de suspendare, respectiv. La o zi după ultima administrare, toți șoarecii, cu excepția celor din grupul NC, au fost injectați intraperitoneal cu CCl4 (0,125% în ulei de arahide, v/v) la o doză de 10 ml · kg -1 pentru a produce leziuni hepatice acute, în timp ce Grupului NC i s-a dat un volum echivalent de ulei de arahide.

Șobolanii Sprague-Dawley masculi cu greutatea de 200 ± 20 g au fost repartizați aleatoriu în șase grupe (n = 6) pentru un experiment consecutiv de 30 de zile, incluzând grupul de dietă normală (ND), grupul de modele de dietă bogată în grăsimi (HFD), control pozitiv (HFD + P) și dozele mici, medii și mari ale grupurilor tratate cu PSO (HFD + H, HFD + M și HFD + L). Animalele din grupul ND au fost hrănite zilnic cu o dietă normală de laborator standard, conform GB14924.3-2010 (Shanghai Keaoxieli Feed Co. Ltd., China), în timp ce celelalte cinci grupuri au fost hrănite cu un rozător comercial AIN-76 dieta (Seebio Biotech (Shanghai) Co. Ltd., China) pentru modelul hiperlipidemiei. Între timp, șobolanii din grupurile HFD + P, HFD + L, HFD + M și HFD + H au fost administrați intragastric o dată pe zi cu Xuezhikang (120 mg · kg -1 kg -1) și PSO (1,0, 2,5 sau 6,0 g · Kg −1 d −1) suspendate în 1% Na-CMC și cele din grupele ND și HFD cu volum echivalent de agent de suspendare, respectiv. Dozele s-au bazat pe metodele raportate anterior și pe aportul uman recomandat de PSO [12, 23].

Pentru ambele modele, greutatea corporală a fost înregistrată la fiecare 2 zile, iar animalele au fost postite peste noapte și sacrificate la sfârșitul perioadei experimentale. Ficatul a fost îndepărtat rapid, clătit bine cu soluție salină rece ca gheața, șters și cântărit. Serul a fost obținut prin centrifugare (4 ° C, 3000 rpm × 10 min). Toate probele de ser și ficat au fost depozitate la -80 ° C până la analiză.

2.5.2. Analiza biochimică

Omogenatele hepatice au fost preparate cu soluție salină rece ca gheața (10%, greutate/volum) pentru analiză biochimică. Indicii de stres oxidativ, inclusiv conținutul și activitatea de malondialdehidă (MDA) și superoxid dismutază (SOD), glutation peroxidază (GPX), aspartat aminotransferază (AST) și alanină aminotransferază (ALT) din ser sau ficat au fost detectați pentru a evalua activitatea antioxidantă utilizând kituri (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China). Nivelurile lipidice, inclusiv colesterolul total seric (TC), trigliceridele (TG), colesterolul lipoproteic cu densitate mică (LDL-C) și colesterolul lipoproteic cu densitate mare (HDL-C) au fost detectate pentru a evalua activitatea hiperlipidemică la șobolani folosind truse comerciale ( Shanghai Zhicheng Biological Technology Co. Ltd., China) conform instrucțiunilor producătorului. Conținutul de proteine ​​din ser sau ficat a fost determinat prin metoda Bradford utilizând BSA ca standard.

2.5.3. Analiza elementelor constitutive ale acidului gras în ficatul șoarecelui

2.6. Analize statistice

Toate valorile au fost exprimate ca medii ± deviație standard (SD). Analiza unică a varianței (ANOVA) și testul de comparație multiplă al lui Tukey au fost utilizate pentru analiza datelor. Diferențele mai mici de 0,05 (P Tabelul 1. Acizii grași au reprezentat 98,46% din greutatea totală a PSO și au constat în principal din acizi grași nesaturați (UFA) cu procentul în greutate de până la 89,34%. Deși conținutul și compoziția UFA din semințele de plante uleiurile pot varia în funcție de tehnicile de extracție, PSO se caracterizează prin abundența dominantă în UFA în conformitate cu comparația dintre datele pentru eșantionul de test PSO prezent preparat prin metoda tradițională presată la rece și cele prin extracția supercritică a dioxidului de carbon sau metoda extracției solventului [10 ] Mai mult decât atât, UFA predominante în PSO au fost determinate ca acizi grași polinesaturați (PUFA), inclusiv n-3 ALA (38,86%), acid n-6 ​​linoleic (LA, 26,74%) și acid oleic (23,74%), sugerând o o porție ridicată de n-3 PUFA (ALA, mai mult de 38%) și un raport scăzut de n-6/n-3 (0,69) în PSO. A fost, de asemenea, coincident cu raportul acizilor grași în șaizeci de soiuri de bujor de copaci care au indicat că raportul n-6/n-3 a fost între 0,4 și 1,6 și șobolan IO din n-3 la FA totale a fost mai mare de 38% [24].

tabelul 1

Conținutul principalilor acizi grași, materii nesaponificabile, tocoferoli totali și fenolici în PSO.

Componente Conținut a
(A) Acizi grași principali (%)
Acid palmitic7,5 ± 2,8
Acid stearic1,8 ± 0,2
Acid oleic24,1 ± 3,7
LA27,2 ± 1,7
ALA39,5 ± 5,1
(B) Aspecte nesaponificabile (mg/100 g)
γ-tocoferol63,4 ± 2,6
Stigmasterol30,8 ± 1,2
γ-Sitosterol955 ± 33
Fucosterol248 ± 17
(C) Total tocoferoli (mg/100 g)76,0 ± 3,1
(D) Fenolici totali (mg/100 g)3,34 ± 0,15

a Datele sunt exprimate ca medie ± SD a trei replici (n = 3).

3.2. Activități antioxidante in vitro

activitatea

Activități de eliminare a PSO in vitro împotriva radicalilor DPPH (a) și hidroxil (b). S-au utilizat EVOO și α-tocoferol ca martori, iar datele au fost prezentate media ± SD a determinărilor triplate ale procentului de eliminare a radicalilor liberi.

3.3. Efecte de protecție împotriva daunelor oxidative induse de CCl4 la șoareci

Multe dovezi sugerează că aportul de nutrienți antioxidanți din surse alimentare oferă beneficii pentru sănătate. Cu toate acestea, există o mare diferență între activitatea antiradicală și cea antioxidantă și acestea nu coincid neapărat. Potrivit lui Tirzitis și Bartosz, activitatea antiradicală poate caracteriza capacitatea compușilor de a reacționa cu radicalii liberi într-o singură reacție de radical liber, în timp ce activitatea antioxidantă reprezintă capacitatea de a inhiba procesul de oxidare, care implică de obicei un set de reacții diferite [40]. . În consecință, toate sistemele de testare care utilizează un radical liber stabil oferă informații despre activitatea de eliminare a radicalilor sau activitatea antiradicală și, în multe cazuri, nu corespunde activității antioxidante. Prin urmare, studiile in vivo au fost efectuate în continuare pentru a înțelege proprietatea antioxidantă reală a PSO în prezentul studiu.

Acizii grași prezenți în ficatul șoarecilor. Valorile sunt exprimate ca medie ± SD (n = 6). a P b P Figura 5 (a), nu au existat diferențe semnificative în creșterea în greutate corporală între cele șase grupuri. Deși animalele din grupul HFD + H au prezentat cea mai mică creștere în greutate, funcția de scădere în greutate a PSO nu a fost legată de suprimarea apetitului, deoarece s-au observat diferențe nesemnificative în aportul zilnic de alimente. Cu toate acestea, grupul HFD a prezentat greutate hepatică semnificativ mai mare, precum și niveluri serice de TC, TG și LDL-C (P Figura 5 (b)). Astfel de diferențe între cele două grupuri au indicat astfel un model de hiperlipidemie indus de dietă, însoțit de afectarea ficatului la șobolani. Spre deosebire de grupul HFD, acele grupuri hrănite simultan cu PSO au prezentat modificări dependente de doză în acești parametri, care au fost în concordanță cu rezultatele benefice ale PSO raportate anterior [12] și, de asemenea, au indicat potențialul său hipolipidemic ca supliment alimentar datorită eficacității eficiente. îmbunătățirea profilului de lipoproteine ​​aterogene.