Abstract

fundal

Obezitatea este o problemă majoră de sănătate publică la nivel mondial. O viață sedentară și o tranziție nutrițională către alimente procesate și diete bogate în calorii sunt factori care contribuie la obezitate. În consecință, a crescut cererea de alimente nutraceutice, cum ar fi produsele pe bază de plante pentru slăbit, care oferă potențialul de a contracara obezitatea. Am emis ipoteza că Opuntia consumul de cladode ar putea ajuta la gestionarea greutății într-un context de prevenire a obezității.

Metode

Acest studiu a fost conceput pentru a investiga efectele anti-adipogene ale liofilizate Opuntia pulberi de cladod (OCP) într-un model celular in vitro pentru diferențierea adipocitelor și un model de șobolan obez indus în dietă bogată în grăsimi (HFD). Au fost testați doi OCP, unul din specii sălbatice O. streptacantha iar al doilea din cele mai cunoscute specii O. ficus-indica.

Rezultate

Pre-adipocitele 3 T3-F442A au fost tratate de OCP în timpul procesului de diferențiere prin insulină. Tratamentul OCP a afectat diferențierea adipocitelor, susținută de conținutul scăzut de trigliceride și o absorbție scăzută de glucoză, care a rămas comparabilă cu cea observată la controalele nediferențiate, sugerând că OCP a exercitat un efect anti-adipogen. Șobolanii Sprague - Dawley au fost hrăniți cu un HFD normal sau, suplimentat sau nu cu OCP timp de 8 săptămâni. Tratamentul OCP a redus ușor creșterea în greutate corporală, greutatea ficatului și a grăsimii abdominale, a îmbunătățit unii parametri metabolici legați de obezitate și a crescut excreția de trigliceride în materiile fecale. Luate împreună, aceste rezultate au arătat că OCP ar putea contribui la reducerea adipogenezei și a depozitării grăsimilor într-un context HFD, în special prin promovarea excreției fecale a grăsimilor.

Concluzii

Opuntia cladodele pot fi utilizate ca supliment alimentar sau potențial agent terapeutic în terapiile bazate pe dietă pentru controlul greutății pentru a preveni obezitatea.

Abstract grafic

adipogeneza

fundal

Obezitatea este o problemă gravă de sănătate de interes global, care nu numai că scade durata de viață, dar este asociată și cu dezvoltarea multor boli cronice, cum ar fi bolile cardiovasculare, diabetul de tip 2, hipertensiunea arterială, bolile hepatice grase și cancerul. Este considerat al cincilea risc de deces la nivel mondial [1, 2].

În 2017, Mexic a avut cea mai mare prevalență globală a obezității la populația adultă (15-74 ani, 32,4%), în timp ce țări precum Japonia sau Coreea au avut cea mai mică incidență (sub 6%). Urbanizarea accelerată, îmbunătățirea condițiilor socio-economice și schimbările alimentare sunt considerate responsabile pentru creșterea dramatică și rapidă a prevalenței obezității. Consumul tradițional de alimente a scăzut în favoarea creșterii consumului de alimente rafinate, precum și a dulciurilor și a dietelor bogate în grăsimi/zahăr [3]. Având în vedere că ratele obezității vor crește până în 2030, sunt necesare noi strategii și acțiuni rentabile pentru prevenirea și controlul obezității la copii, adolescenți și adulți [4]. Promovarea stilurilor de viață sănătoase în populație este o provocare majoră pentru sectorul sănătății. Sunt necesare politici publice cuprinzătoare care vizează inversarea tendinței la nivel mondial, în special în Mexic.

Studiile pe rozătoare au arătat că Opuntia extractele modifică biomarkerii obezității. La șobolanii obezi Zucker, consumul de Nopal a atenuat steatoza hepatică legată de obezitate și a redus anomaliile metabolice legate de obezitate. Oțet sau molecule izolate prezente în Opuntia cladodele, cum ar fi kaempferol sau isorhamnetin, utilizate în modele de șoareci obezi, au coroborat potențialele anti-obezitate și anti-diabetice ale acestor molecule [15,16,17,18,19,20,21]. Aceste studii sugerează că s-ar putea observa efecte remarcabile la modelele obezității induse de o dietă bogată în grăsimi (HFD) la șobolani/șoareci, suplimentată cu Opuntia pulberi cladodice (OCP). Sunt necesare rezultate suplimentare cu modele animale pentru a înțelege mecanismele moleculare care stau la baza acestor efecte.

Creșterea țesutului adipos are loc din cauza creșterii dimensiunii adipocitelor existente sau a numărului de adipocite. Un dezechilibru între aportul de energie și consumul de energie generează un exces în țesutul adipos, rezultând obezitate. Diferențierea pre-adipocitelor în adipocite implică o rețea cuprinzătoare care implică factori de transcripție responsabili de expresia proteinelor cheie care induc formarea adipocitelor mature. Adipogeneza implică, de asemenea, modificări ale morfologiei celulare, inducerea sensibilității la insulină și modificări ale capacității secretoare a celulelor β. Descifrarea mecanismului modului în care anumiți nutrienți afectează diferențierea adipocitelor și adipogeneza este importantă pentru prevenirea obezității și a bolilor conexe [22].

Prezentul studiu a fost conceput pentru a investiga dacă Opuntia speciile exercită proprietăți anti-obezitate examinând efectul anti-adipogen al a două Opuntia pulberi cladodice (OCP) și elucidarea mecanismelor care stau la baza acestor efecte. În acest scop, am folosit pulberi din cele mai sălbatice (OSC) și cele mai domesticite (OFI) Opuntia soiuri. Am ales aceste două specii pentru cea mai mare diferență de gradient de domesticire (de la specia strămoșească (OSC, care crește în habitat sălbatic) până la cea mai răspândită Opuntia pentru producția comercială (OFI). Diferențierea pre-adipocitelor în adipocite a fost examinată prin tratarea a 3 celule T3-F442A [22] cu OCP pentru a investiga efectele la nivel celular. Aceleași pulberi au fost, de asemenea, testate pe un model animal de obezitate prin hrănirea șobolanilor Sprague-Dawley cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) suplimentată sau nu cu pulberile. Acest model animal ne-a permis să examinăm nivelul întregului corp, ca prim pas către încercările umane.

Metode

Reactivi

Cytochalasin B, 2-deoxiglucoza, insulina și mediul Eagle’s modificat de Dulbecco (DMEM) au fost cumpărate de la Sigma - Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Franța). [3 H] -2-deoxiglucoza a fost de la PerkinElmer (Boston; WalthamMA, SUA).

Pregătirea materialului vegetal Opuntia și a pulberii cladode

Opuntia tineri cladodi din specia sălbatică OSC (O. streptacantha Lem., Cv. Tuna Loca) și OFIO. ficus-indica [L.] Mill., Cv. RojoVigor) au fost colectate (aprilie 2010 și 2012) de la Opuntia Germplasm Bank of the Agrobotanical Garden se află în El Orito, Zacatecas, Mexic. Identificarea formală a plantelor a fost raportată de Ramirez-Tobias și colab. [23]. Plantele au fost cultivate în aceleași condiții de mediu [12]. Cladodele au fost spălate, măcinate în azot lichid folosind un polizor KrupsGX 4100 (Mexico City, Mexic) și păstrate la - 80 ° C până la prelucrarea ulterioară. Probele au fost liofilizate (Labconco, Kansas City, MO, SUA), cernute prin plasă 80, apoi depozitate în pungi de plastic la 4 ° C până la utilizare [14]. Conținutul de grăsimi, fibre brute și compuși fenolici totali a fost determinat, după cum sa raportat anterior [12].

Cultura celulară și diferențierea adipocitelor

Cultură de celule

Testul trigliceridelor (TG)

TG intracelular a fost cuantificat folosind kitul enzimatic TG PAP 150 (TG PAP 150, BioMérieux, Marcy l’Etoile, Franța) după liza celulară (0,1 N NaOH). Pentru a ține cont de proliferarea celulară sau de toxicitatea moleculelor, conținutul de TG a fost legat de conținutul de proteine, determinat de kitul enzimatic al acidului bicinconinic (BCA) (Pierce, Thermofischer Scientific, Bordeaux, Franța). Rezultatele au fost exprimate ca procent de celule martor tratate numai cu insulină (50 nM).

Analiza absorbției de glucoză

Absorbția glucozei a fost măsurată în conformitate cu Kim și colab. [24] cu unele modificări [25]. Pe scurt, după 10 zile de tratament, celulele au fost spălate de două ori în DMEM fără ser și pre-incubate în acest mediu la 37 ° C timp de 16 ore. După această perioadă de înfometare, celulele au fost spălate de două ori cu tampon Krebs-Ringer bicarbonat (KRB) și incubate la 37 ° C timp de 30 min cu insulină 100 nM (sau nu, pentru controlul negativ). Pentru a iniția absorbția glucozei, s-a adăugat 2-deoxi- [1-3 H] -glucoză (1 μCi/mL) diluată în soluție 0,1 mMD-glucoză în fiecare godeu și plăcile apoi incubate la 37 ° C timp de 10 min. După incubare, celulele au fost spălate de două ori cu tampon KRB rece cu gheață și lizate în NaOH 0,1 N. Jumătate din conținutul fiecărui godeu a fost transferat în flacoane de scintilație și s-au adăugat 10 ml de cocktail de scintilație (Ultima Gold, Perkin Elmer, Boston, WalthamMA, SUA). Radioactivitatea încorporată în celule a fost măsurată folosind un contor de scintilație lichidă (Hewlett Packard, SUA). Conținutul de proteină BCA a fost testat pentru fiecare punct din jumătatea rămasă.

Determinarea toxicității celulare

După incubare, godeurile au fost clătite ușor cu soluție salină tamponată cu fosfat rece, iar apoi s-au adăugat 20 μL de 5 mg/ml MTT la fiecare godeu și s-au incubat timp de 4 ore. Ulterior, mediul din fiecare godeu a fost aspirat ușor și s-au adăugat 100 μL de dimetilsulfoxid pentru a dizolva cristalele de formazan. Plăcile au fost agitate timp de 30 de minute, urmate de măsurători de absorbanță la 570 nm folosind un cititor de microplăci Tecan (Tecan, Raleigh, SUA).

Experimente pe animale

Animale și diete

Analiza biochimică

Probele de plasmă au fost separate de celulele sanguine prin centrifugare la 1000 ×g timp de 15 min. Nivelurile plasmatice ale leptinei, insulinei și proteinei chimiotratante monocite-1 (MCP-1) au fost analizate prin setul Luminex (RMHMAG-84 K-05) (Thermofisher, Bordeaux, Franța). TG, glucoza și parametrii hepatici (aspartat aminotransferază, AST; alanin aminotransferază, ALT) au fost toți măsurați la Facilitățile Anexplo, Toulouse (Franța). Adiponectina a fost evaluată folosind TECO medical Mediagnost (E091-Rkit, Reutlingen, Germania), iar proteina C reactivă (CRP) a fost măsurată folosind kitul Abcam (ab108827, Abcam, Cambrigde, Marea Britanie).

Măsurarea nivelurilor de trigliceride hepatice și fecale (TG)

Lipidele hepatice au fost extrase prin omogenizarea țesuturilor hepatice în soluție salină tamponată cu fosfat. S-a adăugat etanol la omogenate (1: 9, v/v) și probele au fost amestecate la temperatura camerei timp de 1 oră pentru a solubiliza TG. După centrifugare la 2000 ×g timp de 10 min, supernatantul a fost colectat pentru a măsura nivelul TG folosind kitul enzimatic TG PAP 150 (TG PAP 150, BioMérieux, Marcy l’Etoile, Franța), conform protocolului producătorului. Lipidele TG fecale au fost extrase din fecalele colectate peste 24 de ore. Probele au fost omogenizate în apă sterilizată, apoi centrifugate la 2000 ×g timp de 10 min. Supernatantul a fost colectat pentru a măsura nivelul TG utilizând kitul enzimatic TG PAP 150 (TG PAP 150, BioMérieux, Marcy l’Etoile, Franța), conform protocolului producătorului.

analize statistice

Toate datele au fost exprimate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM) a trei (sau mai multe) experimente independente (experimente cu celule) sau 10 șobolani pe grup (experimente in vivo). Semnificația statistică a fost determinată de analiza unică a varianței (ANOVA), urmată de testul Newman - Keulspost hoc, utilizând software-ul GraphPad Prism. Semnificația statistică a fost indicată de *p §§ p §§§ p § p §§ p FIG. 1

Rezultate

Caracterizarea compușilor biologici în cei doi Opuntia pulberi cladodice (OCP)

Pentru fiecare specie (OSC, OFI), au fost colectate cladode tinere într-un stadiu similar de maturitate. Conținutul de macromolecule, acizi fenolici și flavonoizi și capacitățile antioxidante ale OCP au fost analizate într-un studiu anterior [12]. Rezultatele sunt rezumate în Tabelul 3. Compoziția proximală nu a prezentat diferențe în conținutul de proteine ​​(11,0 și 11,7%) și conținut de grăsimi (0,62 și 0,68%), dar OSC a avut un conținut mai mare de fibre (6,52%), în timp ce OFI a prezentat cel mai mare conținut de cenușă (14,2%). OSC conținea cea mai mare concentrație de compus fenolic (65,1 μg echivalent acid galic/g probă) și capacitate antioxidantă, dar nu s-a observat nicio diferență în conținutul de flavonoizi între cele două specii.

Efecte ale Opuntia pulberi cladodice (OCP) pe 3 T3-F442A diferențiere pre-adipocite

Efectele citotoxice ale pulberilor de cladod Opuntia (OCP)

Pentru a evalua efectele citotoxice potențiale ale OCP, pre-adipocitele au fost diferențiate în adipocite mature timp de 10 zile cu insulină 50 nM, în prezența diferitelor concentrații de OCP (0, 1, 10 și 100 μM). Așa cum se arată în FIG. 1, tratamentul cu OSC (Fig. 1a) și OFI (Fig. 1b) nu a avut un efect semnificativ asupra viabilității celulare, în jur de 100% din control, chiar și cu cea mai mare concentrație de OSC (100 μM). La concentrații mai mici (1 și 10 μM), viabilitatea celulară a fost crescută, posibil datorită unui efect mitogen al OCP.

Pulberile de cladod Opuntia (OCP) inhibă stocarea trigliceridelor (TG) în adipocite

Pentru a examina efectele OCP asupra diferențierii a 3 pre-adipocite T3-F442A în adipocite, celulele confluente au fost tratate cu concentrații în creștere de OCP. Așa cum se arată în FIG. 1c, d, conținutul TG nu a fost afectat de OSC și OFI, în celule nediferențiate (fără insulină). Celulele diferențiate au prezentat o creștere semnificativă a conținutului de TG intracelular (aproximativ 250%), care a fost semnificativ redusă la celulele tratate cu 100 μM OCP (OSC, 60%; OFI, 50%; p FIG. 3

Parametrii metabolici

Efectele suplimentării cu OCP au fost investigate asupra parametrilor metabolici, prin măsurarea nivelurilor serice ale markerilor legați de obezitate (Fig. 4). Așa cum se arată în FIG. 4 a, b, creșterea adipozității a fost asociată cu o scădere a nivelului de adiponectină în grupul F (F = 75% față de SD; p FIG. 4

Dieta HFD a crescut ușor nivelurile de TG circulant (130%), iar acest lucru a fost inversat atât prin suplimentarea OCP (Fig. 4c), dar nu semnificativ. Aceleași observații ar putea fi făcute pentru nivelurile de glucoză circulante. Suplimentarea OCP a avut tendința de a scădea nivelurile de TG și glucoză (Fig. 4c, d). La fel, nivelurile de insulină circulante (Fig. 4e) au fost crescute în grupa F (195%; p Tabelul 4 Markeri hepatici serici

Evaluarea trigliceridelor (TG) la fecale

Rezultatele noastre au indicat faptul că șobolanii hrăniți cu HFD suplimentați cu OCP, au prezentat o masă corporală mai mică și niveluri reduse de TG în ser și ficat în comparație cu șobolanii de control HFD (F). Pentru a înțelege mecanismele implicate în scăderea nivelurilor de TG, conținutul de TG al fecalelor de șobolan a fost măsurat cu 3 zile înainte de sfârșitul experimentelor. Rezultatele din Fig. 5b, indică faptul că concentrația TG a fost crescută în materiile fecale din cele trei grupuri HFD, în special în grupul F-OFI (123%; p

Discuţie

În studiul de față, am investigat efectele asupra obezității a doi OCP, cel mai sălbatic OSC și cel mai domesticit OFI, folosind 3 celule adipocite T3-F442A și șobolani obezi HFD.

În studiul nostru, șobolanii hrăniți cu HFD au câștigat în mod semnificativ mai multă greutate decât cei hrăniți cu o dietă normală, confirmând că obezitatea indusă de dietă a avut succes. Nu s-a observat nicio diferență vizibilă în aportul de alimente între toate grupurile. Interesant este faptul că suplimentarea OCP (F-OSC, F-OFI) a împiedicat greutatea câștigului animalului cu aportul de alimente comparabil. Mai mult, OCP a avut tendința de a reduce dezvoltarea grăsimilor abdominale pe parcursul celor 8 săptămâni de dietă, fără a reduce aportul de alimente. Astfel, putem concluziona că suplimentul OCP din alimente ar putea scădea creșterea în greutate corporală prin reprimarea expansiunii masei țesutului adipos.

Se știe că un HFD induce NAFLD la modelele animale și la oameni, provocând depunerea grăsimilor în ficat [39, 40]. NAFLD este strâns asociat cu obezitatea. În modelul nostru de obezitate hrănit cu HFD, am arătat că suplimentele OCP din dietă tinde să scadă greutatea ficatului, ceea ce poate fi corelat cu o stocare mai mică de TG în ficat. În mod similar, Moran-Ramos și colab. a demonstrat că Opuntia consumul de cladode atenuează steatoza hepatică la șobolanii obezi Zucker [18] și alte studii bazate pe HFD completate cu quercetină [35] sau Vignanakashimae extractele (o altă plantă bogată în flavonoide) [32] au dus, de asemenea, la scăderea creșterii în greutate corporală și la acumularea de lipide hepatice. Luate împreună, aceste rezultate sugerează că OCP ar putea fi eficient împotriva ficatului gras la șobolanii obezi HFD. Este de remarcat faptul că tratamentul OCP nu a provocat efecte toxice adverse detectabile asupra ficatului.

Uebelhack și colab. [9] și Chong și colab. [41] a ilustrat că efectele Opuntia-fibrele derivate acționează în reducerea absorbției grăsimilor din dietă la voluntarii umani, prin legarea la grăsimile din dietă și creșterea excreției acesteia în fecale, probabil prin scăderea absorbției intestinale a grăsimilor. Pentru a înțelege în continuare mecanismele care explică creșterea mai mică în greutate indusă de Opuntia suplimentarea într-un HFD, am evaluat excreția fecală a grăsimilor în modelul nostru de șobolan, care a fost semnificativ crescută la șobolanii hrăniți cu HFD și a fost mult mai pronunțată atunci când șobolanii au fost suplimentați cu OFI. Aceste descoperiri susțin ipoteza că efectele OCP asupra greutății sunt realizate prin reducerea absorbției de grăsimi din dietă, ducând la un aport mai mic de energie și, astfel, la o creștere mai mică în greutate. În cele din urmă, au fost identificate efecte antiinflamatorii nopale. Bouhini și colab. Au arătat o reducere a inflamației cronice de nivel scăzut asociată cu obezitatea, aceasta putând fi cauzată de efectul fibrelor nopale asupra microbiotei intestinale [17, 20].

Concluzii

Studiul nostru a fost realizat folosind un model de șobolan pentru obezitate și un model celular, care permite reducerea numărului de animale utilizate și obținerea de informații despre modul celular de acțiune. Cu toate acestea, utilizarea animalelor a evidențiat scăderea absorbției grăsimilor intestinale și efectele netoxice ale dietei Opuntia pulberi, sugerând potențialul lor de a fi utilizat în dieta umană. Modul de acțiune al Opuntia în managementul obezității trebuie analizate în continuare, dar se pare că unele efecte ar putea fi observate la nivel molecular prin reglarea căii genelor de diferențiere a adipocitelor, prin reducerea absorbției grăsimilor, precum și a unei posibile modificări a microbiotei intestinale. În concluzie, datele noastre sugerează că consumul de cladode OFI poate fi util în gestionarea obezității și prevenirea bolilor hepatice (NAFLD) legate de obezitate.

Disponibilitatea datelor și a materialelor

Seturile de date utilizate și/sau analizate în timpul studiului curent sunt disponibile de la autorul relevant la o cerere rezonabilă.