Abstract

interleukina - 15 (IL-15) este o citokină recent descoperită (20) care aparține familiei cu patru pachete de helice α a citokinelor, care includ și IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7 și IL-9. Rolurile IL-15 în sistemul imunitar s-au dovedit a include proliferarea și supraviețuirea celulelor T CD8 + (6), activarea celulelor naturale ucigașe (11) și proliferarea celulelor B (5). ARNm IL-15 este, de asemenea, exprimat constitutiv într-o mare varietate de tipuri de celule și țesuturi, inclusiv placentă, mușchi scheletic, ficat, celule epiteliale și macrofage activate (20).

IL-15 și IL-2 au roluri redundante rezultate dintr-o compoziție de receptor similară pentru aceste două citokine. Receptorii IL-15 și IL-2 (IL-15R, respectiv IL-2R) sunt structuri trimerice compuse din două lanțuri identice, lanțul β IL-2R/IL-15R (IL-2Rβ) și γ γc comun ) -lant, împreună cu lanțuri α specifice (18). IL-15Rα prezintă o afinitate mare de legare pentru proteina IL-15, cu o Kd de 10 pM (14). În plus față de acțiunile paracrine, IL-15 poate fi exprimată în trans, în care citokina este fie legată de IL-15Rα de la suprafața celulei, fie ancorată la membrana celulară. În acest mod, IL-15 matur poate fi prezentat celulelor vecine care exprimă IL-2Rβ și -γc (7). Deși atât ARNm IL-15 (27) cât și IL-15Rα (19) este exprimat în mușchiul scheletic, nu se știe dacă mARN-ul pentru un IL-15R trimeric funcțional este exprimat și în mușchiul scheletic, ceea ce ar permite trans prezentarea IL-15 de către celulele musculare.

În cadrul mușchiului scheletic, IL-15 poate stimula exprimarea proteinelor din lanțul greu de miozină în miotuburi diferențiate (17, 34). Miotuburile cultivate cu IL-15 au, de asemenea, o morfologie hipertrofică în comparație cu culturile martor care nu conțineau IL-15. În plus, s-a demonstrat că injecțiile zilnice de proteină IL-15 reduc fragmentarea ADN a mușchilor gastrocnemius, atenuează pierderea mușchilor scheletici asociați cancerului (cașexie) și reduc expresia genică a receptorului factorului de necroză tumorală de tip I (TNF) (TNFR) într-un model de cancer la rozătoare (15). Deși aceste rezultate demonstrează un efect pozitiv al proteinei IL-15 exogene în miocite, răspunsul IL-15 intramuscular endogen nu a fost examinat. Mai mult, nu se cunoaște răspunsul IL-15 la pierderea musculară care rezultă din afecțiuni precum îmbătrânirea sau descărcarea musculară.

Toate procedurile experimentale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Școala de Medicină a Universității din Virginia de Vest. Standardele de îngrijire a animalelor au fost urmate de respectarea recomandărilor pentru îngrijirea animalelor de laborator, susținute de Asociația Americană pentru Acreditarea Îngrijirii Animalelor de Laborator și urmând politicile și procedurile detaliate în Ghid pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator publicat de S.U.A. Departamentul de sănătate și servicii umane și proclamat în Legea privind bunăstarea animalelor.

Rozătoare HS.

Încărcare/descărcare aripă.

Estimări RT-PCR ale ARNm.

mușchilor

FIG. 1.Interleukin (IL) -15 specificitate de exemplu. A: RT-PCR a fost efectuată pentru IL-15 în ADNc de la mușchiul scheletic de șobolan (SM), cu ADNc din splina de șobolan (SP) și țesutul hepatic (LV) utilizate ca martori pozitivi. Treizeci și patru de cicluri de PCR la o temperatură de recoacere calculată (TA) de 56,6 ° C au produs benzi de 594 pb în toate cele trei tipuri de țesuturi. B: digestie de restricție a produselor PCR IL-15 din mușchiul scheletal de șobolan și prepeliță cu AluEnzima de restricție. Incubarea produselor PCR la 37 ° C timp de 1 oră a produs fragmentele prezise. PCR, produs PCR complet; RD, produse de PCR digerate cu enzime de restricție.

tabelul 1. Informații despre grundul PCR

TA, temperatura de recoacere; IL, interleukină; R, receptor; γc, γ comun; F, înainte; R, invers.

Secvențierea IL-15Rα.

Amplificarea PCR a secvenței de rattus IL-15Rα produsă de produsul PCR ∼100 bp mai mare decât se aștepta. Produsele PCR corespunzătoare au fost purificate pe gel folosind un kit de extracție a gelului disponibil comercial conform instrucțiunilor producătorului (QIAquick Gel Extraction Kit; Qiagen Sciences) și trimise pentru secvențierea directă (SeqWright DNA Technology Services, Houston, TX). Informațiile de secvență ADNc recent achiziționate au fost apoi comparate cu secvența prognozată de computer utilizată inițial pentru proiectarea primerilor PCR (XM_577598).

analize statistice.

Analizele statistice au fost efectuate folosind pachetul software SPSS, versiunea 10.0. Datele au fost analizate folosind un ANOVA 2 × 2 pentru a examina principalele efecte ale îmbătrânirii și descărcării și interacțiunea vârstă × descărcare. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SE cu semnificație setată la P

masa 2. Caracteristicile mușchilor rozătoarelor

Valorile sunt mijloace ± SE; n, Nu. de animale. HS, suspensie membră posterioară; BM, masa corporală. Caracteristicile a 20 de șobolani Fischer 344 × Brown norvegieni adulți tineri (5-7 luni) și 18 bărbați senescenți (33 luni). NS, nu semnificativ.

* P

FIG. 2.Modificări transcripționale IL-15 după suspendarea membrelor posterioare (HS). A: Expresie ARNm IL-15 în mușchii solei după HS. B: Expresia ARNm IL-15 la mușchii plantari după HS. O interacțiune semnificativă de îmbătrânire × descărcare a fost observată la ambii mușchi scheletici, indicând vârsta influențată răspunsul mARN-ului IL-15. Datele sunt exprimate ca mijloace ± SE cu semnificație la P

Nu a existat nicio interacțiune semnificativă de îmbătrânire × încărcare/descărcare în modelul de prepeliță în niciun moment. Cu toate acestea, a existat un efect principal semnificativ al îmbătrânirii, iar mARN-ul IL-15 a fost cu 53% mai mare la mușchii PAT în vârstă față de mușchii de la păsările tinere adulte. Acest efect principal al vârstei asupra expresiei IL-15 a fost semnificativ pentru toate condițiile: 14 zile de supraîncărcare (F = 5,8, P = 0,024), 7 zile de descărcareF = 97,8, P

FIG. 3.Modificări transcripționale IL-15 ca răspuns la supraîncărcarea aripii și descărcarea ulterioară. Expresia ARNm IL-15 în mușchii patagialis după 14 zile de supraîncărcare întinsă, 14 zile de încărcare urmate de 7 zile de descărcare ulterioară și 14 zile de încărcare urmate de 14 zile de descărcare. Datele sunt exprimate ca mijloace ± SE cu semnificația setată la P

Secvențierea ratului IL-15Rα.

O secvență de ARNm prognozată de computer de la GeneBank pentru lanțul IL-15Rα din rattus a fost utilizată pentru a construi primeri PCR (XM_577598). Produsul PCR a avut o dimensiune prevăzută de 325 bp după amplificare. Cu toate acestea, în urma amplificării PCR și a electroforezei ulterioare pe gel, produsul PCR a fost mai aproape de 400 bp, fără observarea benzilor multiple (Fig. 4A). Produsul PCR a fost purificat pe gel, secvențiat și comparat cu secvența prognozată de computer de la GeneBank. ADNc nou secvențiat a fost identic cu secvența prezisă la capetele 5 ′ și 3 ′, cu o secvență unică de 103 baze conținută în mijloc (Fig. 4B). După verificarea prin secvențierea ADN și digestia de restricție cu HindIII (Fig. 4A), noua secvență a fost trimisă către GeneBank (nr. de acces: DQ157696).

FIG. 4.Secvența unică a receptorului IL-15 α (IL-15Rα) în mușchiul scheletic ratat. A: imagine reprezentativă în gel a IL-15Rα după amplificarea PCR și digestia de restricție cu HindIII. Incubarea produselor PCR la 37 ° C timp de 1 oră a produs fragmentele prezise de 260 și 131 pb. HindSitul de restricție III a fost unic pentru noua secvență IL-15Rα, DQ157696. B: compararea secvenței rat-IL-15Rα după secvențierea ADN-ului. Informațiile despre noua secvență au fost comparate cu o secvență de ARNm prognozată de computer (XM_577598). Ambele secvențe erau identice la capetele 5 și 3, dar noul ADNc secvențiat conținea 103 baze unice.

Expresia IL-15R în mușchiul scheletic.

Grundurile specifice pentru cele trei lanțuri IL-15R (α, β și γ) și lanțul IL-2Rα au fost construite pentru a examina expresia ARNm în mușchiul scheletal de șobolan. ARNm izolat din țesutul splinei rozătoare a fost utilizat ca martor pozitiv pentru fiecare dintre acești primeri (Fig. 5A). Așa cum se arată în FIG. 5B, mușchiul scheletic al șobolanului exprimă ARNm pentru fiecare dintre lanțurile IL-15R. În plus, mARN pentru lanțul α specific IL-2R a fost detectat în splină și în mușchiul scheletic.

FIG. 5.Expresia ARNm a trimerului IL-15R în mușchiul scheletic. A: ca control pozitiv, amplificarea PCR a componentelor individuale ale IL-15R și IL-2R a fost efectuată în ADNc produs din țesutul splinei și comparat cu reacțiile PCR efectuate în ADNc al mușchiului scheletic. Atât splina (A) și mușchiul scheletic (B) țesutul conținea mARN pentru toate componentele IL-15R și IL-2R.

IL-15 și mușchiul scheletic.

Primul raport privind efectele IL-15 asupra mușchiului scheletic și-a demonstrat capacitatea de a crește conținutul de proteine ​​din lanțul greu de miozină în miotuburile C2C12 de șoarece diferențiate in vitro (34). Aceste rezultate au fost ulterior susținute de date în culturile primare de celule musculare scheletice umane (17). Acest efect al IL-15 a fost independent de efectele hipertrofice ale factorului de creștere asemănător insulinei I (33), care poate deveni important odată cu îmbătrânirea atunci când nivelul hormonilor anabolici scade de obicei (40). În acest studiu, mARN-ul IL-15 a fost mai mare la toți mușchii scheletici în vârstă examinați și, în general, a crescut ca urmare a descărcării. Propunem că aceasta este o adaptare legată de vârstă a mușchilor scheletici pentru a contracara pierderea musculară ca răspuns la stimulii atrofici. Studiile viitoare ar trebui să abordeze eficacitatea IL-15 în economisirea masei musculare la animalele în vârstă și ca răspuns la condițiile care promovează atrofia musculară.

IL-15 și apoptoză.

Un rol pentru IL-15 în atenuarea apoptozei este sugerat de datele care arată că proteina exogenă IL-15 inhibă semnalizarea apoptotică asociată căii morții. Apoptoza multisistemică inițiată la șoareci prin tratamentul cu un anticorp anti-Fas a fost suprimată prin injectarea unei proteine ​​de fuziune IL-15-IgG2b de lungă durată (9). În plus, șoarecii transgenici IL-15 sunt rezistenți la o doză letală de Escherichia coli (23). Administrarea de IL-15 la șoareci martori reduce, de asemenea, rata mortalității dintr-o provocare letală de E coli. Datele arată în continuare că administrarea de IL-15 la celule peritoneale izolate in vitro a prevenit apoptoza indusă de TNF-α (23).

Calea bine caracterizată a morții celulare inițiată de legarea TNF-a la TNFR de tip I (adică calea apoptotică extrinsecă) poate fi modificată cu creșteri ale proteinei IL-15. De exemplu, injecțiile zilnice de proteină IL-15 timp de 7 zile într-un model de cancer de rozătoare au dus la scăderi semnificative ale expresiei genice atât a TNFR de tip I cât și de tip II (15). Mai mult, incubația fibroblastelor cu IL-15 in vitro atenuează apoptoza indusă de TNF-α (8). Calea apoptotică TNF-α a fost întreruptă atunci când molecula de semnalizare citoplasmatică TRAF2, care mediază în mod normal semnalul apoptotic din aval de la TNFR, a fost recrutată în partea citoplasmatică a IL-15Rα. Interesant este că această recrutare a TRAF2 către IL-15Rα a fost observată numai atunci când atât proteina TNF-α cât și IL-15 erau prezente în mediul de cultură (8). Astfel, IL-15 pare să funcționeze, cel puțin parțial, pentru a inhiba apoptoza blocând semnalizarea în aval de TNFR. Acest lucru este relevant la îmbătrânirea mușchilor, deoarece calea apoptotică extrinsecă este foarte activă la mușchiul scheletic în vârstă (31). Speculăm că modificările ARNm IL-15 observate în studiul actual pot reprezenta o încercare de a contracara mediul pro-apoptotic observat de obicei la mușchiul scheletic în vârstă.

Un alt mijloc potențial pentru ca IL-15 să funcționeze într-un rol anti-apoptotic poate fi ca urmare a asocierii sale cu proteina anti-apoptotică Bcl-2 (30, 41). Există o reducere a procentului de celule T CD8 + la șoareci IL-15Rα -/- și acest lucru se datorează parțial unei reduceri a expresiei Bcl-2 (41). IL-15 exogen reglează nivelurile de Bcl-2 în aceste celule și contribuie la o reducere a morții celulare la activare (41). În plus, s-a demonstrat că celulele T CD8 + HIV-specifice prezintă niveluri reduse de Bcl-2. Când aceste celule au fost cultivate cu IL-15, expresia Bcl-2 a crescut, iar acest lucru a fost asociat cu o atenuare a apoptozei culturilor de celule T CD8 + (30). S-a demonstrat că expresia ARNm și conținutul de proteine ​​ale Bcl-2 cresc în mușchii scheletici în vârstă și ca răspuns la stimulii atrofici (32, 35). Deși aceste rezultate nu arată un rol anti-apoptotic mediat de Bcl-2 direct pentru IL-15, această posibilitate justifică o investigație suplimentară.

HS la rozătoare.

Modelul HS de descărcare a fost utilizat pe scară largă la rozătoare pentru a studia efectele descărcării pe os (22) și mușchi (2, 3, 16, 38). În studiul actual și altele (3, 24, 32), HS a fost utilizat pentru a examina interacțiunea îmbătrânirii și descărcării. Pierderea de masă și forță musculară asociată îmbătrânirii (adică sarcopenie) este exacerbată cu inactivitatea (39). Masa musculară scade cu -40% între vârstele de 20 și 60 de ani, puterea scăzând cu 20-40% (revizuită în Ref. 12). Studiul actual este în concordanță cu constatările anterioare care arată că mușchiul scheletic în vârstă răspunde diferit la descărcare, în comparație cu mușchiul scheletal adult tânăr (24, 32, 35).

Rezultatele acestui studiu diferă de rapoartele anterioare din laboratorul nostru care au arătat o pierdere musculară mai mare la șobolani FBN în vârstă decât la șobolani adulți tineri după HS (3). Variabilitatea răspunsurilor animalelor la HS poate apărea, chiar și în același laborator (16). De exemplu, Fitts și colab. (16) a raportat variabilitate în atrofia soleului și tensiunea tetanică izometrică de vârf ca răspuns la 1 și 2 săptămâni de HS. Autorii au speculat că variabilitatea acestor date poate fi indusă de răspunsuri diverse în mișcările animalelor sau tulburări de mediu care duc la contracții musculare aleatorii. Tehnica HS are ca rezultat descărcarea membrelor cu inervație musculară lăsată intactă, ceea ce permite membrelor posterioare să se miște liber în spațiu. Inițial, activitatea EMG scade, dar revine la nivelurile de bază imediat după 3 zile de la inițierea HS (1). În studiul nostru, animalele au fost verificate de două ori pe zi după inducerea HS, au fost observate contracții musculare aleatorii ale membrelor posterioare și acest lucru ar fi putut contribui la rezultatele noastre actuale.

În concluzie, mARN-ul IL-15 este exprimat constitutiv în mușchiul scheletic și este receptiv atât la îmbătrânirea musculară, cât și la descărcarea membrelor. Datele noastre indică faptul că îmbătrânirea este un stimul semnificativ pentru expresia crescută a ARNm-IL-15, deoarece efectele principale ale vârstei au fost observate la toți mușchii examinați utilizând două modele de îmbătrânire și la două specii de animale diferite. În plus, mușchiul scheletic exprimă mARN pentru un IL-15R trimeric funcțional, care ar permite prezentarea trans a IL-15 de către celulele musculare. Este posibil ca mușchiul scheletic să răspundă la stimulii atrofici prin creșterea nivelului de IL-15 pentru a fi secretat ca o citokină tradițională sau prin prezentarea IL-15 pe sarcolema legată de IL-15R. Experimentele viitoare ar trebui să examineze efectele directe ale modulării sistemului IL-15/IL-15R ca răspuns la stimulii atrofici ca mijloc de a economisi masa musculară odată cu îmbătrânirea și în perioadele de neutilizare sau leziuni/boli musculare.

Acest studiu a fost susținut de Institutul Național pentru Îmbătrânirea Grant R01 AG-021530 (către S. E. Alway) și Colegiul American de Medicină Sportivă Grant pentru Studenți Doctoranzi RFG-14 (către E. E. Pistilli).