Abstract

  • AgRP, proteină legată de agouti
  • BAT, țesut adipos maro
  • CBA, β-actină de pui
  • CREB, proteina de legare a elementului de răspuns AMPc
  • FFA, acid gras liber
  • MC, melanocortină
  • α-MSH, hormon de stimulare a α-melanocitelor
  • P-CREB, proteină de legare a elementului de răspuns AMPc fosforilat
  • POMC, pro-opiomelanocortină
  • PWAT, țesut adipos alb perirenal
  • rAAV, virus adeno-asociat recombinant
  • RTWAT, țesut adipos alb retroperitoneal
  • UCP1, proteina de decuplare 1
  • WAT, țesut adipos alb

Sistemul central de melanocortină joacă un rol critic în reglarea homeostatică a greutății corporale (1-5). Melanocortinele (MC) sunt peptide bioactive derivate dintr-un preormon comun, pro-opiomelanocortina (POMC), dintre care unul, hormonul de stimulare a α-melanocitelor (α-MSH), este un regulator major al hrănirii și al homeostaziei greutății corporale. Exprimarea redusă a POMC hipotalamic este asociată cu sindroame de obezitate cauzate de mutații ale receptorului leptinei (6,7) sau ale altor gene (tubby, Nhlh2 etc.) (8,9), de leziuni hipotalamice (10) și, probabil, cele mai multe frecvente, prin îmbătrânire (11). Că ARNm hipotalamic POMC redus ar putea contribui la fenotipurile obeze din aceste modele este sugerat de observația că mutațiile genei POMC provoacă obezitate la șoareci (12) și oameni (13). Cu toate acestea, nu este încă clar dacă normalizarea tonului central POMC poate inversa fenotipurile obeze. Prezentul studiu își propune să abordeze această întrebare.

rezultatele

Leptina, un hormon derivat din adipocite, acționează asupra satietății și centrelor de apetit din hipotalamus, atât pentru a reduce consumul de alimente, cât și pentru a crește cheltuielile de energie (14-16). Dovezi recente sugerează că sistemul MC poate fi localizat în aval de calea hipotalamică de semnalizare a leptinei. Leptina activează neuronii care conțin proteine ​​POMC și agouti (AgRP) ale nucleului arcului ventrolateral și respectiv ventromedial, rezultând o creștere a expresiei POMC și o scădere a AgRP (15,17-20). În plus, supresia indusă de leptină a aportului alimentar este blocată efectiv de un antagonist al receptorului MC 3/4 (21) și inducerea mediată de leptină a proteinei de decuplare 1 (UCP1), o proteină termogenă importantă în țesutul adipos maro (BAT) ).), este, de asemenea, atenuat de antagonismul central al receptorilor MC (22).

Șobolanii Zucker obezi genetic fa/fa cu o mutație recesivă a genei receptorului de leptină dezvoltă obezitate severă, cu debut precoce, asociată cu hiperfagie, hiperleptinemie și hiperinsulinemie (23,24). Folosind acest model de rozătoare rezistente la leptină și insulină, am examinat dacă supraproducția de POMC în hipotalamus ar reduce masa corporală și adipozitatea și ar îmbunătăți metabolismul glucozei la șobolanii obezi Zucker. În plus, unele dovezi sugerează că tahifilaxia la reducerea mediată de MC a consumului de alimente se dezvoltă după tratamentul farmacologic cronic al agoniștilor MC la rozătoare (25,26). Astfel, cel de-al doilea scop al acestui studiu a fost de a examina consecințele supraexprimării îndreptate pe termen lung a POMC asupra răspunsului anorexic mediat de MC.

Succesele recente în utilizarea virusului adeno-asociat recombinant (rAAV) pentru a obține expresia pe termen lung a transgenelor oferă o oportunitate de a ne testa ipotezele (27). Există multe avantaje ale utilizării rAAV, inclusiv nonpatogenicitatea, nonimunogenitatea, viabilitatea ridicată a virionului și, cel mai important, expresia pe termen lung a transgenului livrat. Vectorul rAAV de tip 2 a avut un succes unic ca vector de transfer de gene în SNC (28).

În studiul de față, am utilizat un vector rAAV de tip 2 care codifică POMC murin (rAAV-POMC) pentru a evalua consecințele pe termen lung ale livrării genei POMC asupra echilibrului energetic, termogeneza BAT și transducția semnalului MC hipotalamic la șobolanii obezi Zucker În acest scop, am administrat rAAV-POMC sau vectori de control bilateral în nucleul arcuat al hipotalamusului șobolanilor obezi Zucker timp de 38 de zile și am evaluat aportul alimentar, greutatea corporală, adipozitatea, hormonii serici și nivelurile de metabolit, proteina BAT UCP1, POMC hipotalamic, Nivelurile de ARNm AgRP și fosforilarea hipotalamică a proteinei de legare a elementului de răspuns AMPc (CREB) (29).

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Construcția plasmidelor vectoriale rAAV.

pTR-CBA-POMC codifică ADNc POMC murin (un cadou de la Dr. James Roberts) (30) sub controlul promotorului hibrid de citomegalovirus imediat/promotor β-actină (CBA) de pui (31). Elementul de reglare posttranscripțional al virusului hepatitei woodchuck este plasat în aval de transgenul POMC pentru a spori expresia acestuia (32). Plasmida martor, denumită control pTR, este similară cu pTR-CBA-POMC, cu excepția încorporării ADNc care codifică o formă îmbunătățită de proteină fluorescentă verde în loc de ADNc POMC. Vectorul de control a fost descris anterior (33).

Analiza in vitro a plasmidei pTR-CBA-POMC.

Construcția pTR-CBA-POMC a fost testată pentru exprimarea in vitro a POMC prin transfectarea celulelor HEK 293 folosind reactiv de transfecție FuGENE 6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) conform protocolului furnizat de producător. La o zi după transfecție, celulele au fost recoltate și ARN-ul total a fost izolat. Nivelurile de ARNm POMC au fost analizate prin RT-PCR.

Ambalarea vectorilor rAAV.

Vectorii au fost ambalați, purificați, concentrați și titrați așa cum s-a descris anterior (34). Titrurile atât pentru vectorii de control rAAV-POMC, cât și pentru rAAV utilizați în acest studiu au fost de 4,26 × 10 11 particule fizice/ml, iar raportul dintre particulele fizico-infecțioase pentru ambii vectori a fost de 9 particule/injecție în 3 μl) rAAV- POMC (n = 6) sau controlul rAAV (n = 6) în hipotalamusul bazal cu coordonate care vizează nucleul arcuat. Coordonatele pentru injecție în hipotalamus au fost de 3,14 mm posterioare de bregma, ± 0,4 mm laterale de sutura mediatagitală și 10 mm ventrale de la suprafața craniului. De fiecare parte, o gaură mică a fost forată prin craniu și a fost introdusă o canulă de oțel inoxidabil 23-G urmată de o canulă de injecție. Cu utilizarea unei seringi Hamilton de 10 μl, un volum de 3 μl de stocuri de virus a fost livrat timp de 5 minute către fiecare sit. Ace au rămas la locul de injectare timp de încă 5 minute. În momentul intervenției chirurgicale, șobolanii au primit o injecție cu analgezicul Buprenex (0,05 mg/kg; Reckitt și Colman, Richmond, VA).

Recoltarea și pregătirea țesuturilor.

Șobolanii au fost postiti peste noapte și uciși prin luxația cervicală sub 85 mg/kg anestezie pentobarbitală. Probele de sânge au fost colectate prin puncție cardiacă, iar serul a fost recoltat printr-o centrifugare de 15 minute în tuburi separatoare de ser. Sistemul circulator a fost perfuzat cu 30 ml de soluție salină rece, iar BAT, țesutul adipos alb perirenal (PWAT) și țesutul adipos alb retroperitoneal (RTWAT) au fost excizate. Hipotalamusul a fost îndepărtat prin realizarea unei incizii mediale la lobii piriformi, caudală la chiasma optică și anterioară creierului cerebral la o adâncime de 2-3 mm. Țesuturile au fost depozitate la -80 ° C până la analiză. Pentru analiza occidentală, hipotalamusul și BAT au fost omogenizate în 0,3 ml de 10 mmol/l Tris-HCI (pH 6,8), 2% SDS și 0,08 μg/ml acid okadaic. Au fost de asemenea prezenți inhibitori de protează, 1 mmol/l fluorură de fenilmetilsulfonil, 0,1 mmol/l benzamidină și 2 μmol/l leupeptină. Omogenatele au fost fierte imediat timp de 2 minute, răcite pe gheață și depozitate congelate la -80 ° C. Proteina a fost determinată folosind trusa de testare a proteinelor DC (Bio-Rad, Hercules, CA). Probele BAT au fost filtrate printr-un filtru de seringă de 0,45 μm (Whatman, Clifton, NJ) pentru a îndepărta particulele de lipide înainte de măsurarea proteinelor.

Leptina serică, insulina, glucoza, acizii grași liberi și colesterolul.

Leptina serică și insulina au fost măsurate folosind kituri de radioimunologie de șobolan (Linco Research, St. Charles, MO). Acizii grași fără ser (FFA) și colesterolul total au fost determinați prin truse colorimetrice enzimatice de la WAKO Chemicals (Neuss, Germania). Glucoza serică a fost printr-o reacție colorimetrică cu Trinder, reactivul Sigma Diagnostics Glucose (St. Louis, MO).

RT-PCR.

Test CREB și CREB fosforilat.

CREB imunoreactiv și fosforilat (P-CREB) au fost determinați cu un kit de anticorpi PhosphoPlus CREB (Ser 133) (New England Biolabs, Beverly, MA). Probele hipotalamice (40 μg) preparate așa cum s-a descris mai sus au fost separate pe un gel SDS-PAGE și electrotransferate în membrană de nitroceluloză. Imunoreactivitatea a fost evaluată pe membrane separate cu anticorpi specifici CREB (fosforilați și nefosforilați) și anticorpi specifici serinei 133 P-CREB. Imunoreactivitatea a fost vizualizată prin detecție chemiluminiscentă îmbunătățită (Amersham Pharmacia Biotech) și cuantificată prin densitometrie video (Bio-Rad).

Proteina UCP1.

UCP1 imunoreactiv în omogenizații BAT (20 μg) a fost determinat așa cum este descris pentru CREB, cu excepția faptului că a fost utilizat un anticorp specific pentru UCP1 de șobolan (Linco Research).

analize statistice.

Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SE. Măsuri repetate ANOVA a fost utilizat pentru analize ale greutății corporale și ale aportului de alimente. Când efectul principal a fost semnificativ, s-a aplicat un test post hoc t pentru a determina diferențele individuale între medii. Pentru toate celelalte date, s-a folosit testul t al Studentului cu două cozi nepereche. P 0,5).

Greutatea corporală și aportul de alimente.

Livrarea bilaterală a rAAV-POMC în hipotalamusul bazal a redus creșterea în greutate și aportul de alimente la șobolanii obezi Zucker (Fig. 4). Înainte și în ziua livrării vectorului, greutatea corporală medie a șobolanilor tratați cu rAAV-POMC a fost comparabilă cu cea a șobolanilor martor (428 ± 18 față de 403 ± 23 g în ziua 0). După livrarea vectorului, șobolanii cărora li s-a administrat rAAV-POMC au câștigat în mod constant mai puțină greutate, iar diferența de masă corporală dintre cele două grupuri a crescut treptat în cele 38 de zile (Fig. 4A). Deoarece consumul zilnic de alimente de șobolani obezi Zucker a variat considerabil între șobolani individuali (Fig. 4B), aportul zilnic de hrană după livrarea vectorială a fost exprimat și ca procent din nivelurile individuale de bază, reprezentat de aportul zilnic mediu de hrană cu 1 săptămână înainte de administrarea vectorului (Fig. 4B). 4C). Eliberarea hipotalamică de rAAV-POMC a indus un răspuns anorexic susținut la acești șobolani obezi. Inhibarea consumului de alimente a devenit semnificativă statistic începând cu ziua 7 după livrarea vectorului POMC și a durat pe durata experimentului (Fig. 4B și C).