Margaret F. Gregor

1 Departamente de genetică și boli complexe și nutriție și Institutul larg din Harvard și MIT, Harvard School of Public Health, Boston, MA 02115 SUA

Emily S. Misch

1 Departamente de genetică și boli complexe și nutriție și Institutul larg din Harvard și MIT, Harvard School of Public Health, Boston, MA 02115 SUA

Ling Yang

1 Departamente de genetică și boli complexe și nutriție și Institutul larg din Harvard și MIT, Harvard School of Public Health, Boston, MA 02115 SUA

Sarah Hummasti

1 Departamente de genetică și boli complexe și nutriție și Institutul larg din Harvard și MIT, Harvard School of Public Health, Boston, MA 02115 SUA

Karen E. Inouye

1 Departamente de genetică și boli complexe și nutriție și Institutul larg din Harvard și MIT, Harvard School of Public Health, Boston, MA 02115 SUA

Ann-Hwee Lee

2 Departamentul de patologie și medicină de laborator, Weill Cornell Medical College, New York, NY 10065 SUA

Brian Bierie

3 Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA 02142 SUA

Gökhan S. Hotamisligil

1 Departamente de genetică și boli complexe și nutriție și Institutul larg din Harvard și MIT, Harvard School of Public Health, Boston, MA 02115 SUA

Date asociate

rezumat

Adipocitul este esențial pentru metabolismul organismului și prezintă o plasticitate funcțională și morfologică semnificativă în timpul formării și duratei sale de viață. Transformări remarcabile ale acestui organ apar în timpul obezității și alăptării, două procese metabolice în care este esențială o mai bună înțelegere a funcției adipocitelor. Având în vedere importanța critică a reticulului endoplasmatic al organului celular (ER) în adaptarea la fluctuațiile proceselor sintetice, am explorat rolul XBP1, un regulator central al răspunsurilor adaptive ER, în formarea și funcția adipocitelor. În mod neașteptat, ștergerea adipocitului-XBP1 in vivo la șoareci (XBP1 ΔAd) nu a avut niciun efect asupra formării adipocitelor sau asupra metabolismului homeostatic sistemic pe dieta obișnuită sau bogată în grăsimi. Cu toate acestea, în timpul alăptării XBP1 dam barajele de ad au prezentat adipozitate crescută, producție scăzută de lapte și creștere scăzută a așternutului comparativ cu barajele de control. Mai mult, demonstrăm că XBP1 este reglat în timpul alăptării, unde răspunde la prolactină pentru a modifica expresia genei lipogene. Aceste rezultate demonstrează un rol nerecunoscut anterior pentru adipocit-XBP1 în reglarea metabolismului lactațional.

Introducere

Celula grasă, sau adipocitul, este un regulator central al metabolismului care este conservat în organisme de la muște la oameni. La baza funcției adipocite se află capacitatea sa de a stoca și elibera lipide în flux cu cerințele de energie ale organismului. Ca atare, viața adipocitului cuprinde multe fluctuații extreme ale capacității de stocare a lipidelor, începând cu dezvoltarea unui pre-adipocit într-un adipocit matur și apoi continuând să răspundă la semnalele metabolice. De exemplu, adipocitul trebuie să-și epuizeze aportul de lipide în condiții de cerere de energie redusă sau cu energie ridicată, cum ar fi foametea sau alăptarea, sau să-și crească depozitele de lipide în condiții bogate în nutrienți, inclusiv obezitatea (Attie și Scherer, 2009).

Am constatat că ștergerea genetică a adipocitului XBP1 nu, spre deosebire de așteptări, a afectat formarea și funcția țesutului adipos în condiții metabolice homeostatice. Cu toate acestea, raportăm rolul neprevăzut al XBP1 în reglarea funcției țesutului adipos în timpul metabolismului homeoretic sau direcțional al lactației.

Rezultate

Ștergerea in vivo a adipocitului XBP1

adipocitului

(A-C) Suprimarea lentivirală a ARNm-ului XBP1 în preadipocite 3T3L1. (A) Nivelurile de ARNm Xbp1 au fost măsurate prin RT-PCR cantitativă în timp real (QPCR). Preadipocitele care au control sau shRNA XBP1 (iXBP1) au fost induse să se diferențieze cu sau fără rosiglitazonă (10 uM). (B) În ziua a 8-a de diferențiere, nivelurile de ARNm ale genei Adiponectin au fost măsurate prin QPCR și (C) au fost luate imagini de microscopie în fază luminoasă. (D) Nivelurile de proteine ​​XBP1 în explanții de grăsime de la șoareci WT și XBP1 ΔAd după tratament cu sau fără inhibitor de protează MG132 (25μM) timp de 20 de ore pentru a stabiliza proteina XBP1. Extractele de proteine ​​au fost sondate folosind XBP1 sau anticorp Actin (Santa Cruz). * denotă o bandă nespecifică. (E-K) au fost efectuate cu șoareci masculi (n = 7-12) pe dietă bogată în grăsimi (HFD). (E) Greutatea corporală a șoarecilor WT și XBP1 ΔAd în timp pe HFD. (F) Procent de grăsime, (G) Masă slabă și Masă grasă de șoareci WT și XBP1 ΔAd (n = 5-11) măsurată prin analiza DEXA. (H) Colorarea hematoxilinei și a eozinei (H&E) a secțiunilor de țesut adipos de la șoareci WT și XBP1 ΔAd (mărire 100x). Țesut adipos alb inghinal sau epididimal (IWAT sau EWAT). (I) insulină serică și (J) niveluri de adiponectină la șoareci WT și XBP1 ΔAd (n = 5,6). (K) Test de toleranță la glucoză efectuat după 16 săptămâni pe HFD cu (1,0 g/kg injecție de glucoză, n = 6). Toate barele de eroare indică +/- SEM. Vezi și Figura S1.

XBP1 este reglat în timpul alăptării în adipocite

Apoi, am testat o altă condiție extremă a transformării adipocitelor: lactația. De-a lungul sarcinii, greutatea maternă crește și, după naștere, începe lactația și depozitele de lipide din țesutul adipos sunt utilizate ca componente sau energie pentru producerea laptelui. Pentru a realiza această partiție a nutrienților, adipocitele suferă o transformare dramatică care implică epuizarea severă a lipidelor și suprimarea absorbției de glucoză și lipide. Deși acest fenomen a fost observat morfologic (Elias și colab., 1973), se știe puțin despre rolul funcțional al adipocitului în timpul alăptării sau al oricărui mediator molecular implicat în acest proces.

Cu toate acestea, în timpul alăptării, masa țesutului adipos a crescut semnificativ în barajele XBP1 ΔAd, în timp ce a rămas scăzută în barajele WT comparativ cu șoarecii neîncărcați (Fig. 2D, E). De asemenea, am observat creșteri ale nivelului seric al insulinei și leptinei, precum și o tendință spre creșterea greutății corporale totale în barajele XBP1 ΔAd, din nou indicații ale adipozității crescute (Fig. 2F, S2I). În mod surprinzător, așternuturile din barajele XBP1 ΔAd au câștigat mai puțină greutate în timpul alăptării decât cele din barajele WT (Fig. 2G). Apoi, a fost critic să se examineze dacă genotipul matern sau fetal a fost motorul acestui fenotip și dacă barajele WT ar putea salva acest efect. Pentru aceasta, am efectuat experimente de încurajare încrucișată. Alăptarea puilor XBP1 ΔAd de către barajele WT a salvat complet fenotipul puiului și, dimpotrivă, puii WT alăptați de XBP1 damAd au arătat o scădere semnificativă a greutății corporale în timpul alăptării (Fig. 2H). Aceste experimente au demonstrat că efectul asupra greutății puilor a rezultat din genotipul mamei în timpul alăptării și nu a fost rezultatul unui efect in utero. Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că barajele XBP1 care alăptează adăpostesc depozite crescute de lipide ale țesutului adipos, iar nutrienții insuficienți ajung la pui în timpul alăptării.

Contribuția XBP1 la performanța lactației este specifică adipocitelor

Apoi, am analizat greutățile țesuturilor și, de asemenea, am folosit tehnica de colorare a întregii monturi pentru a vizualiza dezvoltarea epiteliilor mamare și a alveolelor în timpul alăptării. În aceste experimente, nu am observat diferențe în greutatea țesutului, morfologia sau gradul de dezvoltare în glandele XBP1 ΔAd comparativ cu martorii WT (Fig. 3E, F). Secțiunile transversale ale țesuturilor colorate de H&E au arătat, de asemenea, o dezvoltare mamară similară între țesuturile WT și XBP1 ΔAd (Fig. S3C). De asemenea, nu am observat picături mari de lipide citoplasmatice aparente în epiteliul alveolar, care ar indica un defect secretor. În cele din urmă, ca un marker al acțiunii prolactinei, am măsurat semnalizarea Stat5 în țesuturile glandelor mamare care alăptează de la șoareci WT și XBP1 ΔAd și nu s-au observat diferențe semnificative între genotipuri (Fig. S3D, E). Prin urmare, datele obținute până în prezent sugerează funcția normală a glandei mamare la barajele XBP1 ΔAd.

Pe scurt, rezultatele obținute la examinarea țesuturilor, investigațiile ex vivo și la mai multe modele independente de ștergere specifice țesutului in vivo demonstrează că ștergerea XBP1 în adipocit este manipularea cauzală care produce un metabolism lactațional perturbat.

Analiza compoziției și cantității laptelui în XBP1 ΔAd baraje

Discuţie

Scăderea greutății puilor dintr-un defect de lactație a fost legată de nivelurile scăzute de trigliceride sau de viscozitatea crescută a laptelui, ceea ce face dificilă eliberarea (Schwertfeger și colab., 2003; Zhu și colab., 2005). Alții au raportat o compoziție similară, dar au scăzut volumul de lapte atribuit scăderii activității lipogene a glandei mamare (Boxer și colab., 2006; Rudolph și colab., 2010). Nu am văzut nicio modificare a compoziției laptelui sau dovezi ale scăderii activității lipogenice în glanda mamară, dar investigarea ulterioară a acestor aspecte poate fi fructuoasă. Prin urmare, sugerăm că funcția glandei mamare poate fi neschimbată la șoarecii XBP1 ΔAd și că semnalele din țesutul adipos sunt necesare pentru a menține nu integritatea funcțională sau de dezvoltare, ci nivelul producției de lapte. Interesant, două semnale hormonale, insulina și leptina, sunt crescute în serul barajelor XBP1 ΔAd în timpul alăptării și acești hormoni sunt, de asemenea, crescuți la femeile obeze. Prin urmare, merită să investigăm efectele mediului hormonal al mamei asupra producției de lapte. De asemenea, este posibil ca alte acțiuni ale XBP1, cum ar fi sinteza și secreția unui mediator necunoscut la nivelul glandei mamare sau un răspuns imunologic, să poată fi implicate în efectul funcției adipocite în timpul alăptării.

Astfel, sugerăm că această lucrare introduce un nou context în care să studieze funcția și biologia adipocitelor, precum și EPU, dat fiind că majoritatea studiilor care implică adipocite s-au concentrat pe homeostazia metabolică. Aici dezvăluim influența adipocitelor asupra metabolismului direcțional sau homeoretic al lactației și anticipăm că studiile viitoare vor descoperi funcții esențiale ale adipocitelor în acest proces vital de creștere și supraviețuire timpurie a mamiferelor.

Proceduri experimentale

Generarea și reproducerea șoarecilor XBP1 ΔAd

Șoarecii C57BL/6 care adăpostesc site-uri loxP în jurul exonului 2 al XBP1 (Lee și colab., 2008) au fost încrucișați la șoareci care poartă gena Cre recombinază sub promotorii aP2, adiponectină sau LysM, toți trei din fundalul genetic C57BL/6. Strategia de reproducere a fost urmată, astfel încât martorii (XBP1 flox/flox-no Cre) și șoarecii experimentali (XBP1flox/flox-Cre) au fost întotdeauna colegi de gunoi. Șoarecii de sex feminin utilizați pentru studiile privind sarcina și alăptarea au provenit de la încrucișări de femele flox/flox-no Cre la masculi flox/flox Cre și au fost hrăniți cu chow de reproducere standard (PicoLabs, Mouse Diet 20). În toate experimentele, numărul de pui de la WT și XBP1 ΔPurturi de anunțuri au fost similare. Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Școala de sănătate publică din Harvard a aprobat toate studiile.

Microdisecție de captare cu laser

Secțiunile de țesut mamar înghețat cu grosimea de 5 μm din lactația din ziua 1 au fost colorate cu H&E cu 20 de minute înainte de microdisecția cu captare cu laser (LCM). LCM a fost efectuat la Centrul de Histopatologie Specializată din Centrul de Cancer Dana-Farber/Harvard din Boston, MA, folosind instrumentul Arcturus PixCell II împreună cu Macro CapSure Caps (Molecular Devices). Pentru fiecare animal, o lamă de două secțiuni în serie a fost capturată timp de 50-60 de minute la o dimensiune a fasciculului laser de 7,5 μm cu o putere de 50 mW. Extracția ARN a celulelor izolate a fost efectuată utilizând kitul de izolare a ARN-ului PicoPure (Dispozitive moleculare) și ADNc a fost sintetizat din ARN-ul total extras (Fermentas). Nivelurile de mRNA Xbp1 șterse (primeri specifici exonului 2) și total (primeri care nu sunt în exonul 2) au fost evaluate prin RT-PCR cantitativă.

Pregătirea monturilor întregi ale glandei mamare

Preparatele de montare integrală a glandelor mamare au fost efectuate conform protocolului găsit pe site-ul web NIH Biology of the Mammary Gland (http://mammary.nih.gov/tools/histological/Histology/index.html). Pe scurt, glandele mamare inghinale # 4 au fost disecate, răspândite pe lamele de sticlă și fixate peste noapte în fixatorul Carnoy. A doua zi, țesuturile au fost hidratate și apoi colorate în pete de carmin-aluminiu peste noapte. Țesuturile au fost deshidratate, curățate în xilen și montate între două lamele de sticlă folosind medii de montare Permount.

Cultură de celule adipocitare

Preadipocitele 3T3L1 și F442A au fost menținute în DMEM suplimentat cu ser de vițel bovin 10%. Pentru a induce diferențierea, celulele 3T3L1 au fost crescute până la confluență și alimentate cu mediu de inducție (DMEM, ser de vițel cosmic 10%, 5 μg/ml insulină, 0,5 mM IBMX, 1 μM dexametazonă, cu sau fără 10 μM Rosiglitazonă). După două zile, mediul a fost schimbat în DMEM, 10% CCS și 5 μg/ml insulină. Celulele F442A au fost diferențiate numai în mediul DMEM-CCS-insulină. Adipocitele au fost considerate complet diferențiate în ziua 8.

Scanare CT

Șoarecii din lactația a 12-a au fost anesteziați și scanați utilizând scanerul GE explore CT 120 Micro-CT. Captarea datelor și reconstrucțiile țesutului adipos au fost făcute utilizând software-ul Osirix.

Colectarea și analiza laptelui

După îndepărtarea peste noapte a puilor pentru a facilita acumularea laptelui, șoarecii au fost anesteziați în lactația din ziua 12. Laptele a fost colectat prin stimularea manuală a mamelonului. Lactoza a fost măsurată în conformitate cu instrucțiunile kitului (Abcam) și proteina totală a fost măsurată prin testul Protein DC (Bio-Rad). Extracția lipidelor s-a făcut pe o probă de 5 μl de lapte și trigliceride, iar conținutul de acizi grași liberi a fost determinat utilizând testele de diagnostic Sigma și, respectiv, WAKO. Analiza lipidomică în profunzime a fost efectuată așa cum a fost descris (Cao și colab., 2008) de Lipomics Inc.

Cuantificarea laptelui

Cuantificarea producției de lapte a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Jara-Almonte și White, 1972). Pe scurt, puii de 10 zile au fost scoși din baraje și au postit 6 ore. Puii au fost apoi returnați la baraje timp de 1,5 ore și greutatea așternutului a fost luată înainte (post-repede) și după muls. Diferența în greutatea așternutului reprezintă cantitatea de lapte consumată.