S.A. și B.C.F. a contribuit în mod egal la acest studiu.

apetitului

Abstract

În ultimii ani, aportul excesiv de nutrienți a fost asociat cu creșterea rapidă a ratelor de obezitate atât în ​​societățile dezvoltate, cât și în cele în curs de dezvoltare (1). În ciuda eforturilor depuse, mecanismele biochimice specifice implicate în reglarea greutății corporale nu sunt pe deplin înțelese.

Gena care exprimă fructoza-1,6-bisfosfataza (FBPaza) este una dintre multele gene reglate în ficat de obezitate și grăsimi (10,11). Chiar dacă FBPaza este cunoscută ca enzimă de reglare în gluconeogeneză, un studiu anterior din laboratorul nostru a arătat că șoarecii transgenici FBPază specifici ficatului cu un nivel fiziologic triplu de supraexpresie nu au avut nicio modificare a toleranței la glucoză a întregului corp sau a producției endogene de glucoză (12). În mod surprinzător, șoarecii au prezentat în mod constant o reducere de aproximativ 10% a greutății corporale comparativ cu colegii negativi (12), ceea ce ne-a determinat să propunem că FBPaza hepatică poate avea un rol nou în controlul greutății corporale.

Prin urmare, am investigat acest potențial rol de reglementare al FBPazei hepatice utilizând modelul nostru de șoarece transgenic care supraexprimă în mod specific FBPaza în ficat. Raportăm că supraexprimarea acestei enzime hepatice duce la fenotipul greutății corporale slabe la șoarecii transgenici prin reducerea semnificativă a nivelurilor de adipozitate cu ~ 50%. S-au constatat că reducerile consumului de alimente, mai degrabă decât cheltuielile ridicate de energie, sunt factorii care contribuie. Neuropeptidele stimulatoare ale apetitului, neuropeptida Y (NPY) și peptida asociată cu Agouti (AgRP) au fost suprimate semnificativ, în timp ce hormonii de sațietate circulanți, colecistochinina (CCK) și leptina, au crescut semnificativ. Creșterea FAO hepatică printr-un flux crescut prin calea de biosinteză a hexozaminei (HBP) pare a fi cheia care leagă creșterea FBPazei hepatice de aportul redus de alimente și adipozitatea la șoarecele nostru transgenic.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Animale.

Șoarecii transgenici hemizigoti (bărbați și femele) care supraexprimă gena FBPase a ficatului uman (FBP-1) în mod specific în ficat și controalele lor negre potrivite vârstei, ambii pe un fond C57Bl6/J, au fost folosiți, cu excepția cazului în care se specifică altfel. Șoarecii au fost generați, întreținuți și genotipați așa cum s-a descris anterior (12). Toți șoarecii au fost întreținuți în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului de etică animală din spitalul Austin (AEC # s: A2007/2752 și A2009/03766).

Studii privind echilibrul energetic.

Șoarecii au fost adăpostiți individual și au furnizat o dietă standard de laborator (3% grăsimi, 77% carbohidrați, 20% proteine) și apă ad libitum. Greutățile corporale au fost măsurate la 4, 8 și 12 săptămâni și ulterior în fiecare săptămână până la vârsta de 22 de săptămâni. Aportul alimentar (g/zi) a fost măsurat în fiecare săptămână de la vârsta de 12 până la 22 de săptămâni. Plăcuțele de grăsime subcutanată, infrarenală și gonadală au fost colectate și cântărite în starea non-fastid. Activitatea fizică voluntară, cheltuielile de energie de repaus (REE), coeficientul respirator (RQ) și nivelurile de oxidare a grăsimii și glucozei din întregul corp au fost evaluate așa cum s-a descris anterior (13-16).

Vagotomie de ramură hepatică.

Vagotomia de ramură hepatică comună a fost efectuată pe șoareci anesteziați de 16 săptămâni care vizează în mod specific ramura nervului vagal, conexiunea majoră dintre ficat și creier (17). O incizie laparotomică a fost făcută pe linia mediană ventrală, iar peretele abdominal a fost deschis cu o a doua incizie. Ramura vagală hepatică comună a fost localizată (sub ficat) și transectată, întinzându-se fascia care conține ramura hepatică comună folosind o pință fină. O incizie similară a fost făcută, de asemenea, la șoarecii acuzați, iar nervul vag hepatic a fost localizat, dar nu a fost transectat. Inciziile au fost suturate, șoarecilor li s-a administrat soluție salină (1 ml) intraperitoneal pentru a ajuta la recuperarea postoperatorie și li s-a permis recuperarea timp de 1 săptămână. Aportul alimentar și greutatea corporală au fost ulterior măsurate săptămânal timp de 10 săptămâni.

Inhibarea farmacologică a FBPazei.

Șoarecii transgenici FBPase, martorii negativi ai colegilor (cu vârsta de ∼16 săptămâni) și șoarecii NZO (cu vârsta de 7 săptămâni) au fost administrate zilnic cu o doză de 5 mg/kg de benzoxazol benzen sulfonamidă, un inhibitor de FBPază specific umane disponibil în comerț (Calbiochem) (18, 19), pentru a viza în mod specific construcția sau vehiculul nostru (apă) cu 2 ore înainte de ciclul întunecat (perioada de alimentare) timp de 10 zile. Măsurătorile greutății corporale și ale aportului alimentar au fost luate zilnic. În a 10-a zi de tratament, plasma a fost colectată de la șoareci anesteziați în stare hrănită (1 oră ciclu întuneric) prin puncție cardiacă, întregul creier a fost colectat și depozitele de grăsime au fost colectate și cântărite.

Studiu antagonist al receptorilor CCK1.

Șoarecii transgenici FBPase și colegii negativi (cu 10 săptămâni) au fost injectați intraperitoneal cu o doză de 300 μg/kg de lorglumidă, un antagonist al receptorului CCK1 (CCK1R) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) (20) sau vehicul salin la debutul ciclului întunecat și consumul de alimente a fost înregistrat 24 ore mai târziu.

Studiul 3-β-hidroxibutiratului.

Șoarecii C57BL/6J masculi (în vârstă de 10 săptămâni) au fost injectați subcutanat cu o doză de 10 mmol/kg de acid DL-3-hidroxibutiric (sare de sodiu, puritate 98% 3-β-hidroxibutirat [BHB]; MP Biomedicals) (5) sau ser fiziologic la debutul ciclului întunecat. Greutatea corporală și aportul de alimente au fost măsurate 1 și 2 ore după aceea. Șoarecii au fost lăsați să se recupereze timp de o săptămână, iar administrarea de BHB a fost repetată pentru colectarea plasmei la o oră după administrare.

Analize de hormoni și metaboliți.

Puncțiile cardiace au fost efectuate pe șoareci transgenici anesteziați și pe colegii negativi (cu vârsta de ∼16 săptămâni) în stare hrănită (1 oră în ciclul întunecat). Grelina circulantă a fost măsurată folosind o imunoanaliză enzimatică specifică (Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont, CA), CCK circulant a fost măsurată printr-un radioimunoanaliză internă (21), iar leptina circulantă a fost măsurată prin radioimunotest (Linco Research, St Charles, MO) . BHB a fost măsurat din probe de plasmă cardiacă colectate după un post peste noapte folosind un kit de reactivi 3-hidroxibutirat II (Helena Laboratories Australia Pty Ltd, Melbourne, VIC, Australia). Testele de fructoză-1,6-fosfat (F-1,6-P) și fructoză-6-fosfat (F6P) au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (10).

Studiul inhibitorilor FAO.

Șoarecii transgenici FBPase și colegii negativi (cu vârsta de 10 săptămâni) au fost capturați cu o singură doză (10 mg/kg) de etomoxir, un inhibitor al carnitinei palmitoyl-CoA transferază (CPT) -1a (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) (22) sau vehicul salin la debutul ciclului de întuneric. Aportul de alimente a fost înregistrat 24 de ore mai târziu.

N-acetilglucozamină transferază O-legată RL2 Western blot.

Omogenatele de proteine ​​hepatice au fost procesate și colectate așa cum s-a descris anterior (23), iar nivelurile de proteine ​​RL2, indicative ale N-acetilglucozaminei transferazei (OGT) legate de O (5135 kDa) (24) au fost determinate prin Western blot așa cum s-a descris anterior (25).

Disecția hipotalamică.

Secțiunile hipotalamice (nucleul arcuat [ARC]) și nucleul paraventricular (PVN, ca martor)) au fost colectate la șoareci hemizigoti (∼16 săptămâni) și la șoareci homozigoti (∼24 săptămâni), la 1 oră în ciclul întunecat ca anterior descris (13,16,26).

Măsurarea nivelurilor de expresie a ARNm în hipotalamus și ficat.

ARN a fost extras din probe de ARC, PVN și ficat folosind TRIzol (Invitrogen, Mount Waverley, VIC, Australia), tratat cu DNaseI (Ambion, Scoresby, VIC, Australia), iar ADNc a fost sintetizat folosind 1 μg de ARN tratat cu DNază și aleatoriu grunduri cu kit-ul Promega Reverse Transcription (Annandale, NSW, Australia). AgRP și proopiomelanocortina (POMC) primeri pentru SYBR-verde în timp real PCR au fost proiectate pe o graniță intron-exon pentru a asigura neamplificarea ADN genomic. Primeri POMC: înainte 5'-CTG GCC CTC CTG CTT CAG-3 '; invers 5'-GGA TGC AAG CCA GCA GGT T-3 '(0,3 μmol/L fiecare). Primeri AgRP: înainte 5'-TCC CAG AGT TCC CAG GTC TAA G-3 '; invers 5'-TAG CAC CTC CGC CAA AGC-3 '(0,3 μmol/L fiecare). Amorsele pentru controlul endogen al α-actinei au fost obținute așa cum s-a descris anterior (27). Testele de expresie a genei TaqMan (Applied Biosystems, Scoresby, VIC, Australia) au fost utilizate pentru OGT (Mm00507300_m1), CPT-1a (Mm00550435_m1), CPT-1c (Mm00463970_m1), proliferator de peroxizom - receptor activat (PPAR4is) proliferator (MAP39 - receptor activat-γ coactivator-1 (PGC1) -α (Mm01208832_m1), leptină (Mm00434759_m1) și NPY (Mm00445771_m1). Amestecul de grund 18S de la ABI a fost utilizat ca martor endogen. A fost utilizat software-ul de detectare a secvenței ABI și cuantificarea relativă utilizând metoda comparativă ΔCt.

analize statistice.

Nervul vag servește ca linie principală de comunicare între ficat și SNC și are atât efecte inhibitoare, cât și stimulatoare asupra consumului de alimente (44,45). Într-adevăr, vagotomiile ramurilor hepatice la șoarecii noștri transgenici au crescut aportul de alimente și, în consecință, creșterea în greutate corporală, demonstrând o cerință pentru semnalizarea nervului vagal. De fapt, am constatat o creștere clară cu 30% a nivelurilor circulante de CCK și leptină la șoarecii transgenici, hormoni despre care se știe că acționează prin nervul vag, susținând un rol pentru acest nerv în medierea efectelor de sațietate ale FBPases. Mai mult, studiile care folosesc antagonistul CCK1R specific, lorglumida, au arătat în mod clar aportul crescut de alimente la șoarecii transgenici la niveluri similare observate la șoarecii negativi. Descoperirea paradoxală a creșterii leptinei la șoarecii transgenici este surprinzătoare având în vedere că leptina este strâns reglementată cu adipozitate. Există posibilitatea ca FBPase să activeze un semnal din ficat către țesutul adipos pentru a stimula producția și secreția de leptină, cu toate acestea, acest lucru nu a fost investigat. Cu toate acestea, datele noastre oferă sprijin critic pentru implicarea importantă și esențială a nervului vag în greutatea corporală modificată a șoarecilor transgenici FBPase.

Grupul nostru a demonstrat anterior că nivelurile crescute de BHB circulant, un produs secundar al FAO hepatică, este legat de nivelurile crescute de CCK la om (21). Șoarecii noștri transgenici au, de asemenea, niveluri crescute de BHB circulant, iar când BHB a fost administrat la șoareci C57BL/6J, consumul de alimente a scăzut, ceea ce a fost asociat cu o concentrație mai mare de CCK circulant. Aceste date nu numai că susțin o legătură pozitivă între nivelurile de BHB și CCK, așa cum se observă la om (21), dar oferă și dovezi directe că cetonele sunt eficiente în scăderea consumului de alimente prin stimularea CCK. Cu toate acestea, mecanismul (mecanismele) prin care BHB reglează producția și secreția CCK nu este înțeles. Creșterile observate în CPT1-a, regulatorii săi PGC1-α și PPARα (33,46) și aportul crescut de alimente după inhibarea etomoxirului, susțin datele BHB și constatarea generală a creșterii FAO și sunt în concordanță cu creșterea observată în oxidarea grăsimilor din întregul corp (RQ și ratele de oxidare a grăsimilor). Datele noastre demonstrează pentru prima dată că FAO crescută joacă un rol cheie în apetitul redus al șoarecilor transgenici FBPază specifici ficatului.

În concluzie, arătăm că o reglare superioară specifică a FBPazei în ficat duce la creșterea FAO, supraproducția de BHB, stimularea eliberării CCK și a leptinei și generarea unui semnal vagal care duce la o reducere a hormonilor stimulatori ai apetitului, NPY și AgRP și o reducere ulterioară a consumului de alimente. Propunem că expresia crescută a FBPazei hepatice după excesul de nutrienți, cum ar fi o dietă bogată în grăsimi (10,11), este un mecanism nou de feedback negativ dezvoltat pentru a limita creșterea în greutate ca răspuns la o abundență de grăsimi dietetice. În plus, descoperirea noastră oferă dovezi puternice că orice medicament care inhibă cu succes FBPaza va duce la creșterea în greutate. Spre deosebire de tiazolidindionele sensibilizante la insulină care cresc subcutanat, dar scad depunerea de grăsime viscerală (49), utilizarea inhibitorilor FBPazei ar crește, de asemenea, toate depozitele de grăsime, potențial agravând controlul metabolic pentru pacienții cu diabet de tip 2. Am demonstrat în mod clar că FBPaza hepatică ar trebui privită nu numai ca un mediator al metabolismului glucozei, ci și ca un important regulator al apetitului și adipozității.

MULȚUMIRI

Această lucrare a fost finanțată de Consiliul Național de Sănătate și Cercetare Medicală din Australia (APP # 566784).

Nu au fost raportate potențiale conflicte de interese relevante pentru acest articol.

Autorii mulțumesc următoarelor persoane de la Departamentul de Medicină (Austin Health), Universitatea din Melbourne, pentru asistența lor tehnică excelentă: Zheng Ruan, Rebecca Sgambellone, Christian Rantzau, Amy Blair, Cassie Bush, Kavi Jayatileka și Therese Boehm. Autorii îi mulțumesc, de asemenea, dr. Daniela M. Sartor (Departamentul de Medicină [Austin Health], Unitatea de farmacologie clinică și terapie, VIC, Australia) pentru furnizarea lorglumidei pentru experimentul antagonist CCK1R.