Editat de Donald Pfaff, Universitatea Rockefeller, New York, NY și aprobat pe 13 mai 2019 (primit pentru examinare 18 februarie 2019)

Semnificaţie

Genomul și transcriptomul hipotalamic al hamsterului siberian au fost secvențiate și adnotate pentru a identifica căile transcripționale care prezintă plasticitate sezonieră în echilibrul energetic. Adaptarea la zilele scurte de iarnă a inversat obezitatea sezonieră și proopiomelanocortina hipotalamică reglată în jos, iar triiodotironina exogenă a restabilit creșterea în greutate și expresia proopiomelanocortinei. Analizele in silico au identificat evoluția motivelor de legare a receptorilor hormonului tiroidian în promotorul proximal al genei proopiomelanocortină a hamsterilor și a altor Cricetidae. Provocările energetice impuse de restricția alimentară au provocat răspunsuri neuropeptidice orexigenă și anorexigenă în hipotalamus, dar nu au afectat proopiomelanocortina, care a fost reglementată doar de fotoperioadă. Proopiomelanocortina hipotalamică este menținută prin semnalizarea triiodotironinei condusă de fotoperiod și, prin urmare, oferă o organizare temporală adaptativă pe termen lung a sistemelor fiziologice care reglează echilibrul energetic.

Abstract

Reglarea reostatică a proceselor fiziologice este omniprezentă (1), iar reproducerea sezonieră programată pe termen lung și echilibrul energetic sunt un exemplu evident. Ciclurile sezoniere de amplitudine mare în echilibrul energetic și creșterea somatică sunt comune în natură și oferă o oportunitate unică și valoroasă de a identifica căile genomice și moleculare implicate în controlul reostatic al fiziologiei (2 ⇓ ⇓ –5). Hamsterii siberieni (Phodopus sungorus) prezintă modificări semnificative ale echilibrului energetic pe măsură ce se adaptează de la vară la mediu de iarnă în natură: o scădere a lungimii zilei (adică, fotoperiodă) sub ∼13 h lumină/zi declanșează infertilitate sezonieră, anorexie și o scăderea dramatică a grăsimii corporale (2). În consecință, Phodopus oferă un model unic și important pentru mecanismele neuroendocrine, fiziologice și comportamentale care guvernează reglarea sezonieră pe termen lung a greutății corporale și a reproducerii (2, 5); aceste schimbări fenotipice robuste în fiziologie și comportament pot fi recapitulate în laborator doar cu manipulări de lungimea zilei (fotoperioada).

Rezultate si discutii

Caracterizarea genomului hamsterului siberian și a diiencefalului fotoperiodic.

Reglarea fotoperiodică pe termen lung a expresiei hipotalamice pomc. Modificarea medie ± SEM (A) a masei corporale și (B) expresia mRNA pomot hipotalamic la hamsterii siberieni masculi adulți după 8 săptămâni de expunere la LD (bare albastre) sau SD (bare roșii) și 2 săptămâni de tratament zilnic cu T3 (5) pg; sc). (A) Tratamentul cu T3 a crescut masa corporală în LD și în SD (*** P 0,30; Anexa SI, Fig. S6). Insuficiența T3 singur în conducerea activității luciferazei în această analiză poate indica faptul că sunt necesare căi de semnalizare intracelulare suplimentare sau că reglarea funcțională transcripțională bazată pe T3 la promotorul proximal pomc necesită elemente de amplificare distală.

Reglarea expresiei pomcului hipotalamic prin fotoperioadă vs. Alimente.

POMC în sine este funcțional inert, dar este clivat în mai multe peptide, dintre care unul, hormonul de stimulare a α-melanocitului, este un inhibitor puternic al aportului de alimente (23). Șoarecii pomc-knockout sunt obezi (24), iar foamea acută reglează în mod semnificativ expresia pomc, indicând rolul său central în homeostazia energetică (25). Prin urmare, am evaluat impactul restricției acute a alimentelor asupra greutății corporale și răspunsurile neuropeptidelor hipotalamice legate de homeostazia energetică (pomc, cart, npy și argp). Hamsterii masculi și femele au fost acut (16 h) cu restricții alimentare (FR) după 12 săptămâni de adaptare la fotoperioade LD sau SD. Din nou, hamsterii au cântărit mai puțin în SD (P 0,05; Fig. 2E), în concordanță cu rapoartele anterioare (16 ⇓ –18). Luate împreună, aceste date indică faptul că pomc hipotalamic nu este inhibat de echilibrul energetic negativ acut la hamsterii siberieni, dar susține ipoteza că expresia pomc este în schimb asociată cu stări de schimbare metabolică pe termen lung (sezoniere), în special cele legate de schimbările predictive ale corpului greutatea și metabolismul asociate cu ajustări sezoniere/fotoperiodice.

discutie generala

Hamsterii siberieni au apărut ca un model cheie de specie pentru investigațiile ritmurilor biologice pe o perioadă de timp anuală (26, 27). Genomul hamsterului elaborat în această lucrare, combinat cu prevalența îmbogățirii pentru semnalizarea POMC în datele ARN-seq, a facilitat în mod direct identificarea inserțiilor motivelor de legare a Thrb în promotorul proximal pomc, care a fost identificat ulterior și în Siria de reproducere sezonieră. hamsteri, șoareci de căprioară și mușchi de prerie. Un model demn de remarcat a fost creșterea expresiei pomc la hamsterii LD, care apără un set de greutate corporală mai mare și se clasifică ca obezi. O observație bazată pe modele biomedicale comune de mamifere, de exemplu, șoareci și oameni, este că pomc are efecte anorexigenice asupra consumului de alimente și a apetitului din cauza îmbinării ARN-ului direcționat către producerea de α-MSH ca neuropeptidă principală. Cu toate acestea, la hamsterii siberieni acțiunile pomc pot fi determinate de modificări posttraduționale, cum ar fi creșterea expresiei carboxipeptidazei E pentru a conduce la felierea pomc alternativă și sinteza neuropeptidelor (28).

Rezultatele experimentului 4 oferă dovezi convergente în sprijinul pomcului ca prim candidat pentru reglarea fotoperiodică pe termen lung a echilibrului energetic, independent de indicii energetici pe termen scurt. FR a provocat creșterea așteptată a npy și agrp, dar a fost complet ineficientă în inhibarea pomc, confirmând alte rapoarte la această specie (16 ⇓ –18). Într-adevăr, o creștere paradoxală nesemnificativă a pomc a fost observată la hamsterii SD, care poate reflecta un strat suplimentar de modulație fotoperiodică a răspunsului la lipsa de alimente. Lucrările anterioare au indicat o relativă insensibilitate a pomcului hipotalamic, a masei corporale, a hormonului luteinizant sau a hormonului foliculostimulant la leptină la hamsterii LD (16). Colectiv, aceste date indică faptul că expresia pomot hipotalamică este reglementată de indicii predictivi pe termen mai lung, cum ar fi fotoperioada (probabil prin semnalizare T3), independent de indicii energetici mai proximali, cum ar fi cei care fac referire la disponibilitatea alimentelor pe termen scurt (de exemplu, FR) sau adipozitatea, adică, leptina).

În cele din urmă, disponibilitatea unui genom adnotat și a transcriptomului hipotalamic al unui mamifer foarte sezonier poate permite o înțelegere mai profundă a căilor de semnalizare moleculară care traduc indicii de mediu în semnale biologice sezoniere, ceea ce este relevant pentru înțelegerea și atenuarea impactului perturbării sezoniere asupra sănătății și sănătății. bunăstarea la animale umane și neumane (34).

Metode și materiale

Detalii suplimentare ale protocoalelor experimentale sunt descrise în anexa SI.

Utilizarea și etica animalelor.

Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Chicago, Institutul Național de Sănătate Ghid pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (35) sau Comitetul de evaluare a bunăstării și eticii animalelor de la Universitatea din Aberdeen și au fost efectuate sub licența Home Office (PPL 70/7917). Toate procedurile au fost în conformitate cu liniile directoare ARRIVE. Hamsterii siberieni (P. sungorus) au fost folosiți în aceste studii. Hamsterii au fost adăpostiți în cuști de polipropilenă iluminate timp de 15 ore sau 9 ore pe zi (LD sau respectiv SD; luminile stinse la 1700 ore CST). Alimentele [[Teklad (fostul Harlan)] și apa filtrată de la robinet au fost furnizate ad libitum.

Secvențierea genomului, asamblarea De Novo și analizele transcriptomului.

Fluxul de lucru pentru analiza datelor pentru asamblarea și adnotarea genomului este prezentat în apendicele SI, Fig. S1. ADN-ul genomic a fost extras din țesutul hepatic al doi hamsteri masculi adulți utilizând DNeasy (Qiagen; catalog nr. 69504), iar cantitatea a fost determinată utilizând spectrofotometria Nanodrop (ThermoFisher Scientific). O bibliotecă cu capăt asociat cu o dimensiune de inserare de 250 bp a fost pregătită și secvențiată pe un instrument Illumina HiSeq2000 la Facultatea Genomică a Universității din Chicago. S-au generat un total de 918 milioane de citiri de 100 bp asociată, atingând o adâncime de 37 × (Anexa SI, Tabelul S1). ARN hipotalamic a fost extras folosind Qiagen RNeasy (catalog nr. 74104), iar cantitatea a fost evaluată folosind Nanodrop. Bibliotecile terminale împerecheate au fost pregătite și secvențiate pe un instrument Illumina HiSeq 2000 la Facilitatea Genomică a Universității din Chicago. Transcriptomul a fost reconstruit folosind o conductă de asamblare Trinity de novo (v2013-02-25) (36). Transcrierile exprimate diferențial între grupuri au fost identificate atât la nivelul genei, cât și la nivelul izoformei utilizând pachetul Bioconductor edgeR (37), cu probe din același grup ca replicile biologice din cadrul grupului. A se vedea apendicele SI, tabelul S2 pentru modificarea expresiei pliurilor și valorile P corectate de FDR.

Cuantificarea expresiei ARN hipotalamic.

Hipotalamusul a fost disecat și expresia tshβ, deiodinază tip II (dio2) și deiodinază tip III (dio3) au fost măsurate pentru a confirma manipularea fotoperioadei (anexa SI). ARN hipotalamic a fost extras din țesuturi folosind TRIzol (ThermoFisher Scientific). ADNc a fost sintetizat folosind SuperScript III (Invitrogen), iar ADNc a fost stocat la -20 ° C. qPCR pentru expresia ARNm în țesutul hipotalamic au fost efectuate folosind Bio-Rad CFX96. Anexa SI, Tabelul S5, descrie parametrii qPCR pentru fiecare țintă și transcriere de referință. Am folosit PCR Miner (38) pentru a calcula eficiența reacției și pragurile ciclului, iar probele au fost evaluate pe baza informațiilor minime pentru publicarea ghidurilor PCR cantitative în timp real (39).

Hibridizarea in situ a unor gene fotoperiodice selectate.

Distribuția ARNm a unor gene fotoperiodice selectate (tshβ, dio2, dio3, pomc) a fost examinată în secțiuni hipotalamice coronare prin hibridizare radioactivă in situ. Secțiuni groase de douăzeci de microni ale hipotalamusului au fost tăiate și montate pe lamele acoperite cu polililizină. Riboprobele au fost generate din fragmente generate de PCR clonate așa cum s-a descris anterior (33). Hibridizarea in situ a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (40).

Reglarea fotoperiodică și triiodotironină a pomc.

Hamsterii au fost adăpostiți în grup în LD (n = 15) sau transferați în dulapuri SD (9L: 15D; n = 16) pentru 8 săptămâni (Arrowmight). Hamsterii LD și SD au fost apoi împărțiți în două grupuri de tratament care au primit zilnic control salin (LD + S și SD + S) sau injecții cu 5-ug T3 (LD + T3 și SD + T3). Dimensiunile probei finale ale grupului de tratament au fost LD + S (n = 9), LD + T3 (n = 6), SD + S (n = 8) și SD + T3 (n = 8). Aceste regimuri de dozare și injecție au fost selectate pe baza lucrărilor anterioare (41 ⇓ –43).

Impactul restricției alimentare asupra expresiei pomc.

Acest experiment a folosit hamsteri siberieni adulți (adult6 luni; n = 23). Hamsterii au fost adăpostiți în LD (n = 12) sau transferați în SD timp de 12 săptămâni. Greutățile corporale au fost măsurate înainte de tratamentul fotoperiodic (0 săptămâni) și apoi la intervale de 2 săptămâni până în săptămâna 12, cu puțin înainte de stingerea luminilor. În ultima zi a experimentului, un subset de hamsteri LD și SD a fost ținut pe hrana ad libitum (n = 10) sau i s-a îndepărtat complet hrana (adică restricție alimentară; FR, n = 13). FR a început chiar înainte de stingerea luminilor în ultima seară. În general, au existat patru grupuri experimentale: LD alimentat ad libitum (n = 5), SD alimentat ad libitum (n = 5), LD-FR (n = 7) și SD-FR (n = 6).

Analize statistice.

Sigmaplot a fost utilizat pentru toate analizele statistice, cu excepția cazului în care se specifică altfel. Pentru experimentele 2 și 4, am efectuat repetate ANOVA bidirecționale pentru a examina impactul tratamentului SD asupra greutății corporale. Am efectuat ANOVA bidirecționale pentru experimentul 2 (factori: fotoperiodă vs. injecție T3) și experimentul 4 (factori: fotoperioadă și restricție alimentară) pentru a analiza efectul injecțiilor zilnice T3 sau restricția alimentară asupra modificării greutății corporale și a expresiei genelor hipotalamice . Semnificația a fost determinată la P 1 Cui îi poate fi adresată corespondența. E-mail: tyler.stevensonglasgow.ac.uk .

transcriptomului