Melissa A. Whidden

1 Departamentul de Kinesiologie, West Chester University, West Chester, SUA,

Bilgen Basgut

2 Departamentul de farmacologie, Universitatea Near East, Cipru de Nord, Turcia,

Natalia Kirichenko

3 Geriatric Research, Education and Clinical Center, Department of Veterans Affairs Medical Center, Gainesville, SUA,

4 Departamentul de farmacologie și terapie, Universitatea din Florida, Gainesville, SUA,

Benedek Erdos

5 Departamentul de farmacologie, Universitatea din Vermont, Burlington, SUA,

Nihal Tümer

3 Geriatric Research, Education and Clinical Center, Department of Veterans Affairs Medical Center, Gainesville, SUA,

4 Departamentul de farmacologie și terapie, Universitatea din Florida, Gainesville, SUA,

Abstract

[Scop]

Atât îmbătrânirea, cât și consumul unei diete bogate în sare sunt asociate cu modificări clare ale sistemului vascular care pot duce la dezvoltarea bolilor cardiovasculare; cu toate acestea mecanismele nu sunt clar înțelese. Prin urmare, am examinat dacă îmbătrânirea și consumul de sare în exces modifică funcția semnalizării canalului dependent de ATP de potasiu în arterele mezenterice

[Metode]

Șobolanii tineri (7 luni) și bătrâni (29 de luni) Șobolanii Fischer 344 x Brown Norvegia au fost hrăniți cu un control sau o dietă bogată în sare (8% NaCl) timp de 12 zile, iar arterele mezenterice au fost utilizate pentru măsurarea reactivității vasculare.

[Rezultate]

Relaxarea endoteliului indusă de acetilcolină a fost semnificativ redusă la arterele vechi (81 ± 4%) în comparație cu arterele tinere (92 ± 2%). Pre-tratamentul cu glibenclamidă blocantă a canalului de potasiu-ATP a redus relaxarea la acetilcolină în arterele tinere, dar nu a modificat dilatarea în arterele vechi. La o dietă bogată în sare, dilatarea endoteliului la acetilcolină a fost semnificativ redusă în arterele sărate vechi (60 ± 3%) în comparație cu arterele martor vechi (81 ± 4%). Glibenclamida a redus dilatarea indusă de acetilcolină în arterele sărate tinere, dar nu a avut niciun efect asupra arterelor sărate vechi. Dilatarea până la cromakalim, un deschizător de canale de potasiu-ATP, a fost redusă în arterele de sare vechi în comparație cu arterele de control vechi.

[Concluzie]

Aceste descoperiri demonstrează că îmbătrânirea afectează relaxarea dependentă de endoteliu în arterele mezenterice. Mai mult, o dietă bogată în sare modifică funcția semnalizării canalului dependent de potasiu-ATP în arterele mezenterice vechi izolate și afectează medierea stimulilor de relaxare.

INTRODUCERE

În mod independent, atât îmbătrânirea, cât și consumul unei diete bogate în sare sunt asociate cu modificări clare ale sistemului vascular care pot duce la dezvoltarea bolilor cardiovasculare 1-8. Deoarece bolile cardiovasculare sunt principala cauză de mortalitate în țările majore, mecanismele care contribuie la modificările observate în vasculatură sunt de o importanță semnificativă. Arterele mici de rezistență sunt critice din punct de vedere fiziologic pentru reglarea tensiunii arteriale și a fluxului local de sânge și este bine cunoscut faptul că îmbătrânirea și o dietă bogată în sare induc în mod egal modificări structurale și funcționale în aceste artere 9-13 .

Una dintre modificările funcționale majore ale vasculaturii observate atât cu îmbătrânirea normală, cât și prin ingestia de cantități mari de sare este disfuncția endotelială. Celulele endoteliale dirijează tonul mușchiului neted vascular subiacent prin eliberarea mai multor factori care acționează pentru relaxarea vasului. Mediatori de oxid nitric (NO), ciclooxigenaza (COX) și factorul hiperpolarizant derivat din endoteliu (EDHF) acționează pentru a dilata arterele de rezistență. Odată cu înaintarea în vârstă, vasodilatația redusă dependentă de endoteliu a fost caracterizată prin vasodilatația redusă mediată de agonist 14. În mod similar, animalele tinere normotensive care sunt hrănite cu o dietă bogată în sare (HS) prezintă o atenuare dramatică a răspunsurilor de relaxare vasculară 10, 11, 15, 16. Vasorelaxarea dependentă de endoteliu în aorta și arterele proximale mari depinde aproape în totalitate de NO 14, în timp ce EDHF joacă un rol în vasorelaxarea indusă de agonist în arterele de rezistență distală, inclusiv în cele din patul mezenteric 17 .

Hiperpolarizarea prin deschiderea canalului de potasiu este un mecanism fundamental pentru vasorelaxarea vaselor mici. Canalele de potasiu dependente de ATP sunt ținte importante ale mediatorilor eliberați din endoteliul 18-20. Canalele de potasiu ATP sunt închise de ATP și compuse din subunități Kir 6 și un receptor de sulfoniluree 21. Din cunoștințele noastre, niciun studiu nu a evaluat efectul combinat al vârstei și al consumului de sare din dietă asupra funcției canalului KATP asupra vasodilatației endoteliului. Prin urmare, scopul acestui studiu a fost de a examina efectele vârstei și ale dietei HS asupra relaxării endoteliului în artera mezenterică a șobolanului (MA). Am emis ipoteza că atât vârsta, cât și o dietă HS ar avea ca rezultat o reducere a relaxării endoteliului MA. Mai mult, am crezut că semnalizarea canalului ATP de potasiu va fi modificată atât la șobolanii în vârstă, cât și la cei cu hrană HS.

METODE

Animale experimentale și design

Șobolani tineri (5 luni) și bătrâni (27 luni) masculi Fischer 344 x Brown Norway (F344 x BN) au fost obținuți de la Harlan Laboratories (Indianapolis, IN, SUA). Șobolanul F344 x BN a fost ales pentru aceste experimente, deoarece trăiesc mai mult decât tulpina Wistar sau F344 în absența anomaliilor specifice bolii 22. Șobolanii au fost adăpostiți individual și întreținuți pe un ciclu de lumină-întuneric de 12:12 ore (0600-1800 h). Experimentele au fost efectuate conform principiilor directoare în îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, iar procedurile au fost aprobate de Comitetul instituțional local de îngrijire și utilizare a animalelor.

Șobolanii au fost repartizați aleatoriu în unul din cele patru grupuri: (1) martor tânăr (dietă standard pentru șobolani; 15% grăsimi, 3,1 kcal/g; dietă-2018; Harlan Teklad, Madison, WI, SUA; n = 8); (2) sare tânără (8% NaCI; 15% grăsime; 3,0 kcal/g; TD-92012; Harlan Teklad, Madison, WI, SUA; n = 8); (3) control vechi (dieta standard pentru șobolani; n = 8); și (4) sare veche (dietă NaCl 8%; n = 8). Animalele au fost hrănite cu dieta standard și HS timp de 12 zile și apoi supraanesteziate cu pentobarbital (120 mg/kg ip).

Determinarea reactivității vasculare

Patul arterial mezenteric a fost îndepărtat imediat și plasat într-o soluție de bicarbonat Krebs-Ringer modificată la rece (care conținea (în mM) 118 NaCI, 4,7 KCl, 25 NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 1,2 MgSO4, 2,5 CaCl2 și 5,5 glucoză). Cu ajutorul unui microscop de disecție, AM de ordinul doi au fost recoltate cu atenție. O secțiune din AM (

2 mm lungime) a fost transferat într-o cameră a vasului, montat și fixat între două micropipete de sticlă cu o sutură de 10-0. Camera vasului a fost transferată într-o etapă de microscop cu lumină inversată (Axiovert 100, Zeiss, Thornwood, NY, SUA) cuplată la un analizor de dimensiuni video (Ion Optix, comutatorul Hyper Corporation). Analizorul de dimensiune video a fost conectat atât la un monitor video (pentru vizualizarea vasului), cât și la un computer pentru înregistrarea constantă a diametrului intraluminal al vasului. Soluția Krebs oxigenată (20% O2 - 5% CO2 - 75% N2), menținută la 37 ° C, a fost circulată continuu prin baia vasului. În plus, lumenul vasului a fost umplut cu soluție Krebs prin micropipete. Canula de ieșire a fost blocată în timp ce canula de intrare a fost conectată la un rezervor ridicat pentru a menține o presiune intraluminală constantă de 80 mmHg. Medicamentele au fost adăugate în soluția de baie și a fost efectuat un singur experiment de concentrație-răspuns pe segment arterial.

Pentru a facilita analiza răspunsurilor dilatatoare, s-au adăugat cantități adecvate de fenilefrină (PE) pentru a restrânge arterele la aproximativ 60% din diametrul lor inițial. Aceasta a oferit o gamă largă pentru analiza modificărilor de diametru în timpul relaxării și a oferit un nivel similar de constricție vasculară inițială. Nu au existat diferențe semnificative în răspunsurile arterelor de șobolan tineri și bătrâni sau alimentate cu HS la PE și am adăugat aceeași cantitate de PE la toate arterele (10-6 M). Protocoalele experimentale nu au fost inițiate până când diametrul vasului nu a fost stabil pe o perioadă de 15 minute.

Am testat relaxarea dependentă de endoteliu efectuând experimente de concentrație-răspuns cu acetilcolină (ACh; 10 -8 M - 10 -5 M). De obicei, AM au fost expuși la fiecare doză de ACh timp de cel puțin 6 minute și s-au determinat răspunsurile maxime. Funcția canalelor KATP a fost examinată cu 10 uM de glibenclamidă (un inhibitor selectiv al canalului KATP) și cromakalim (10 -8 M până la 10 -4 M) și deschizător de canale KATP. Adăugarea de glibenclamidă la baia arterială cu 10 minute înainte de ACh nu a modificat diametrele maxime interne pasive ale oricărui MA din grupurile noastre.

Modificările diametrului vasului sunt prezentate ca procente (%) de dilatare a vaselor preconstricte, calculate după cum urmează:% vasodilatație = [(Dagonist - Dbase)/(Dmax-Dbase)] x100, unde Dmax este diametrul maxim al vasului în timpul echilibrării, Dbase este diametrul vasului la contracția stării de echilibru indusă de PE înainte de relaxarea indusă de medicament, iar Dagonist este diametrul vasului după stimularea medicamentului. Cu această metodă, dilatația maximă este reprezentată ca 100% și diametrul de bază este 0% 23 .

Produse chimice

ACh, PE și glibenclamidă au fost obținute de la Sigma (St. Louis, MO, SUA), unde cromakalimul a fost obținut de la Tocris Cookson (Bristol, Marea Britanie). Toate medicamentele au fost dizolvate în soluție Krebs, cu excepția cromakalimului, care a fost dizolvat în soluție de 10% DMSO și Krebs. Aceeași concentrație de DMSO singur nu a avut niciun efect asupra diametrului vasului.

Evaluarea expresiei canalului K + de către Western Blot

Arterele mezenterice au fost omogenizate și testate pentru a determina cantitativ nivelurile de proteine ​​ale subunităților canalului KATP. Probele de țesut au fost omogenizate în 50 mM Tris (pH 7,0) cu leupeptină și conținutul de proteine ​​a fost evaluat prin testul proteinei DC (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA). O cantitate egală de proteine ​​pentru fiecare probă a fost separată prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă prin geluri de poliacrilamidă cu gradient de 12,5% conținând 0,1% dodecil sulfat de sodiu pentru

1 oră la 100 mA. După electroforeză, proteinele au fost transferate în membranele de nitroceluloză la 90 V timp de 1:30. Pentru a controla diferențele de încărcare și transfer de proteine, membranele au fost colorate cu Ponceau S și analizate. Membranele au fost spălate și ulterior blocate cu lapte degresat 5% în soluție salină tamponată cu Tris conținând 0,1% Tween 20 timp de 1 oră la temperatura camerei și ulterior incubate peste noapte la 4 ° C cu un anticorp primar (anti-Kir6.1 sau anti-Kir6 .2; Santa Cruz Biotechnology Inc, Dallas, TX, SUA diluție 1: 500). Această etapă a fost urmată de incubare la temperatura camerei cu un anticorp secundar (Donkey anti-capr IgG-HRP; Santa Cruz Biotechnology Inc) timp de 1 oră. Toți anticorpii legați au fost detectați prin chemifluorescență (ECL Plus Western Blotting Detection System; GE Healthcare), scanate (Storm 860 Phosphorimager Scanner; GE Healthcare) și analizate folosind software-ul Image Quant.

Analize statistice

tabelul 1.

Control tânăr (n = 8) sare tânără (n = 8) control vechi (n = 8) sare veche (n = 8)
Vârsta (luni)552727
Greutate (g)434 ± 13401 ± 23581 ± 31 * # 576 ± 14 * #
Diametrul maxim al vasului (μm)362 ± 10334 ± 8331 ± 9373 ± 11
Constricție la PE (%)60 ± 459 ± 355 ± 454 ± 5

Datele sunt mijloace ± SE

Vasorelaxarea indusă de ACh a fost semnificativ redusă la MA vechi în comparație cu arterele tinere (Figura 1). Relaxarea la ACh la fiecare concentrație examinată (-8 M până la -5 M) a fost semnificativ redusă în vechile MA de control în comparație cu arterele de control tinere (P -5 M) a fost de 92 ± 2% în MA de control tinere și doar 81 ± 4% în vechile artere martor (P Figura 1). Relaxarea la ACh (10 -5 M) a fost de 60 ± 3% în MA vechi de sare față de 81 ± 4% în arterele martor vechi (P * Scăzut semnificativ față de controlul tânăr (P # Scăzut semnificativ față de controlul vechi) (P Figura 2) Relaxările maxime la ACh au fost de 92 ± 2% și 85 ± 1% în arterele de control tinere cu și fără glibenclamidă. În schimb, în ​​arterele vechi, tratamentul cu glibenclamidă nu a avut niciun efect asupra răspunsurilor vasculare deja diminuate induse de ACh. (Figura 2) Relaxările la -5 M Ach au fost de 81 ± 3% în MA vechi și 69 ± 5% în MA vechi pretratate cu glibenclamidă.

semnalizarea

DISCUŢIE

Aceste experimente oferă informații importante cu privire la rolul canalelor KATP asupra funcției endoteliale la șobolanii în vârstă hrăniți cu o dietă bogată în sare. Principalele constatări ale acestui studiu sunt (1) vasorelaxarea dependentă de endoteliu este redusă la șobolanii în vârstă și afectată în continuare pe o dietă bogată în sare, (2) canalele KATP contribuie la relaxarea dependentă de endoteliu provocată de Ach în arterele mezenterice tinere, totuși, în arterelor vechi, relaxarea mediată de aceste canale ionice lipsește și (3) semnalizarea defectuoasă funcțională a canalului KATP poate contribui la afectarea funcției endoteliale legate de vârstă și dietă bogată în sare.

Canalele KATP joacă un rol important în vasorelaxarea indusă de agonist în arterele de rezistență mici. Deschiderea canalelor de potasiu pe celulele musculare netede vasculare cu hiperpolarizare rezultată joacă un rol central în arterele de rezistență distală. Sa demonstrat că ACh activează aceste canale ionice în mai multe paturi circulatorii. În studiul de față, am utilizat glibenclamidă pentru a bloca deschiderea canalului KATP, iar în arterele tinere (martor și sare mare), relaxarea indusă de ACh a fost semnificativ redusă. Această constatare oferă dovezi că canalele KATP contribuie la dilatarea indusă de ACh în arterele mezenterice tinere de șobolan. Cu toate acestea, relaxările deja reduse induse de ACh în arterele vechi (de control și cu sare ridicată) nu au fost afectate în continuare de aplicarea glibenclamidei. Astfel, prezentele date demonstrează că dilatarea atenuată indusă de ACh la animalele vechi pare a fi cauzată de semnalizarea și/sau activarea canalului KATP afectat.

Sunt necesare investigații suplimentare pentru a releva modul în care modificările șobolanilor vechi cu conținut ridicat de sare afectează funcția acestor canale K + ale celulelor musculare netede vasculare. O posibilitate este aceea că vârsta în combinație cu o dietă bogată în sare crește producția de specii reactive de oxigen (ROS) în țesutul vascular, care influențează structura și activitatea acestor canale ionice. Următoarele dovezi susțin această ipoteză. În primul rând, s-a dovedit că producția de superoxid este crescută în arterele mezenterice atât la șobolani vechi, cât și la șobolani alimentați cu sare. În al doilea rând, relaxările mediate de canalul K + sunt afectate în condiții fiziopatologice atunci când apare o producție excesivă de ROS, de exemplu, în timpul ischemiei-reperfuzii 31, 32, a leziunilor cerebrale 33, 34 sau a hiperglicemiei 35, 36. Astfel, afectarea răspunsului vascular mediat de canalul ATP de potasiu în arterele mezenterice vechi cu sare ridicată ar putea fi, de asemenea, consecința producției crescute de ROS.

În concluzie, rezultatele prezentului studiu indică faptul că consumul excesiv de sare în timpul îmbătrânirii normale afectează semnificativ funcția semnalizării canalului KATP în arterele mezenterice de șobolan, iar semnalizarea modificată a acestor canale influențează medierea relaxării dependente de endoteliu. Reglarea vasculară modificată poate fi responsabilă de creșterea tensiunii arteriale și de un risc crescut de evenimente cardiovasculare la populația vârstnică, în special acele persoane care consumă exces de sare zilnic.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de Serviciul de cercetare medicală al Departamentului Afacerilor Veteranilor (Dr. Nihal Tumer), Institutul Național de Îmbătrânire T32> AG000196 (Dr. Melissa Whidden), TUBITAK (Dr. Bilgen Basgut) și American Heart Association (Dr. Benedek Erdos).