Abstract

Până în prezent, nicio dovadă in vitro nu a arătat un rol diferențial pentru cele două izoforme principale ale căii ERK (ERK1 și -2) și sunt activate de aceiași stimuli. Cu toate acestea, dizabilitatea in vivo ERK1 sau -2 duce la fenotipuri diferite, demonstrând roluri diferite pentru cele două izoforme. Embrionii de șoareci lipsiți de ERK2 mor în uter înainte de ziua 8.5 din cauza unui defect al dezvoltării trofoblastului și mezodermului (10,11). Dimpotrivă, șoarecii ERK1 -/- sunt viabile și fertili; au maturizarea deficitară a timocitelor (12) și o memorie îmbunătățită pe termen lung (13).

izoformul

Folosind animalele ERK1 -/- (12), am studiat implicarea acestei izoforme în adipogeneza in vivo și in vitro. Perturbarea genei ERK1 modifică dezvoltarea țesutului adipos la șoareci pe o dietă normală și duce la rezistență la obezitate indusă de grăsimi bogate în grăsimi. Arătăm că fibroblastele și preadipocitele embrionului de șoarece izolate din țesutul adipos adult al șoarecilor ERK1 -/- au afectat adipogeneza. Prezentăm dovezi că acest defect poate fi atribuit lipsei specifice a ERK1, deoarece adipogeneza reziduală a celulelor ERK1 -/- nu este afectată de U0126, un inhibitor foarte puternic și specific al MEK. Prin urmare, analiza ERK1 -/- animalelor și celulelor leagă în mod clar diferențierea adipocitelor afectate de adipozitatea redusă și rezistența la obezitate indusă de grăsimi.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Am generat șoareci ERK1 -/- de la heterozigoti emiși de la șase încrucișări cu animale C57BL/6, așa cum s-a descris anterior (12), iar controlul a venit de la același încrucișat. Șoarecii erau găzduiți pe un program de 12 ore de lumină/întuneric și aveau acces gratuit la apă și alimente. Sarcina bogată în grăsimi (45% grăsimi, 35% carbohidrați și 20% proteine) și dieta standard (10% grăsimi, 70% carbohidrați și 20% proteine) au fost achiziționate de la SAFE (Epinay/Orge, Franța). Experimentele au fost efectuate urmând linii directoare etice standard (liniile directoare ale Uniunii Europene privind îngrijirea în laborator a animalelor) și au fost aprobate de către Facultatea de Medicină a Universității din Nice-Sophia Antipolis.

Diferențierea celulelor și a adipocitelor.

Fibroblastele embrionare de șoarece au fost preparate în ziua 14 postcoitum așa cum s-a descris anterior (14). Preadipocitele din țesutul adult au fost izolate din tampoanele de grăsime subcutanate ale șoarecilor în vârstă de 8 săptămâni (15). Apoi, 2 zile de celule postconfluente au fost tratate timp de 48 de ore cu un cocktail de diferențiere a adipocitelor conținând 5 μg/ml insulină, 0,25 μmol/l dexametazonă, 0,5 mmol/l IBMX (3-izobutil-1-metilxantină) și 10 μmol/l tiazolidindionă. Mediul a fost apoi înlocuit timp de 6 zile de mediul Eagle modificat de Dulbecco numai cu insulină și tiazolidindionă. Acumularea de trigliceride a fost măsurată folosind un kit (Triglyceride 100; ABX Diagnostics, Montpellier, Franța). Activitatea glicerol-6-fosfat dehidrogenazei a fost măsurată conform descrierii (16).

PCR cantitativă în timp real.

Analiza expresiei genice a fost efectuată cu un ABI Prism 7000 (Applied Biosystems) și cu reactivi SYBR Green (Eurogentec, Seraing, Belgia). ADNc-urile au fost sintetizate din 2 μg de ARN total folosind transcriptaza inversă Superscript II (Invitrogen). Setul de grunduri a fost proiectat în conformitate cu software-ul producătorului. Probele conțineau 1 × SYBR Green Master Mix, 0,5 μmol/l primer și 1/50 ADNc sintetizat într-un volum de 25 μl. Condițiile PCR au fost după cum urmează: 10 min la 95 ° C, apoi 40 de cicluri de 15 s la 94 ° C, 30 s la 60 ° C și 1 min la 72 ° C. Am folosit 36B4 ca control intern.

Studii metabolice.

Testele de toleranță la glucoză și insulină au fost efectuate pe animale în vârstă de 13 până la 14 săptămâni la 7 săptămâni după începerea dietei. Glucoza (2 g/kg) și insulina (0,75 UI/kg) au fost administrate prin injecție intraperitoneală la șoareci treji. Probele de sânge au fost extrase din vena cozii la momentul indicat și glicemia a fost determinată folosind un test biochimic (Glucose PAP 250; ABX Diagnostics) și benzile active Accu-Check (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania). Cuantificarea trigliceridelor și a acizilor grași liberi a fost efectuată folosind, respectiv, trigliceridele 100 (ABX Diagnostics) și NEFA-C (Wako Chemicals, Neuss, Germania) kituri biochimice.

Cheltuieli de energie, coeficient respirator și activitate locomotorie.

Șoarecii au fost plasați timp de 22 de ore într-o cușcă metabolică conectată la un sistem de calorimetrie indirectă cu circuit deschis, cu debitul de aer ajustat la 0,5 l/min. Temperatura din cușca metabolică (24 ± 1 ° C) a fost stabilă și controlată pe tot parcursul experimentului. Consumul de oxigen și producția de dioxid de carbon au fost înregistrate la intervale de 10 s, utilizând un program de achiziție de date asistat de computer. Procesarea asistată de computer a schimburilor respiratorii și a semnalelor de activitate spontană a făcut posibilă calcularea acelei părți din rata metabolică totală dedicată alimentării costului energetic al activității și astfel (prin extragerea continuă a energiei cheltuite cu activitatea) pentru a calcula metabolismul de repaus al acestor șoareci în mișcare liberă (17). Șoarecii au fost adăpostiți în cușca metabolică la 1000 de ore fără hrană, dar cu apă. Cheltuielile de energie de repaus postabsorbtive (echivalent cu metabolismul bazal) au fost măsurate între 1600 și 1800 de ore. La 1800 h, 1 g din dieta obișnuită bogată în grăsimi a fost administrată șoarecilor, iar răspunsul termogen la hrănire (metabolism și coeficient respirator [RQ]) a fost calculat timp de 8 h ca creștere a metabolismului și RQ peste nivelurile inițiale premeal.

Măsurarea activării ERK.

Extractele de țesut au fost preparate utilizând tampon de liză (9) și au fost analizate prin Western blot folosind anticorpi împotriva ERK fosforilat pe Thr202/Tyr204 (Cell Signaling Technology) și ERK total (Santa Cruz).

REZULTATE

Șoarecii ERK1 -/- au adipozitate redusă în comparație cu animalele de tip sălbatic.

Dieta bogată în grăsimi stimulează activitatea ERK în țesutul adipos alb.

Pentru a investiga rolul căii ERK în dezvoltarea obezității, șoarecii au fost supuși unei diete bogate în grăsimi (45% din totalul caloriilor provin din grăsimi). Am întrebat dacă dieta bogată în grăsimi a indus activarea căii ERK în țesutul adipos alb, ficat și mușchi. Așa cum se arată în FIG. 2 (și datele nu sunt prezentate), dieta bogată în grăsimi nu a avut niciun efect asupra expresiei ERK1 și -2 în cele trei țesuturi. Mai mult, activitatea ERK nu este modificată în ficat (Fig. 2A) și mușchi (date neprezentate) în regimul hipercaloric. În schimb, activitatea totală a ERK a fost de peste trei ori mai mare în țesutul adipos alb de la șoareci cu o dietă bogată în grăsimi, comparativ cu animalele din dieta standard (Fig. 2B). Interesant este faptul că adipocitele de la pacienții obezi cu diabet zaharat de tip 2 au activitate ERK mai mare decât pacienții martori (18), sugerând o corelație importantă între activitatea ERK crescută și obezitate.

Șoarecii cu deficit de ERK1 sunt rezistenți la obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi și mai sensibili la insulină.

Pentru a determina dacă dizabilitatea ERK1 previne apariția obezității, am analizat incidența dietei bogate în grăsimi la șoarecii de tip sălbatic și knockout. Așa cum era de așteptat, șoarecii de control au devenit în mod semnificativ obezi în urma unei diete bogate în grăsimi, în comparație cu colegii lor cu o dietă standard (10% din caloriile totale din grăsimi). În schimb, șoarecii ERK1 -/- nu au dezvoltat obezitate (Fig. 3A). Într-adevăr, la o dietă bogată în grăsimi, creșterea medie în greutate pe săptămână a fost semnificativ mai mare la șoarecii martor decât la șoarecii ERK1 -/- (2,9 ± 0,4 vs. 1,7 ± 0,3 g/săptămână, respectiv; P -/- animale sub dieta grasă, tampoanele de grăsime inghinale și grosimea subcutanată a grăsimii au fost reduse cu 51 și, respectiv, 30% (Fig. 3B). alternativ, deoarece dizabilitatea ERK1 nu a blocat complet dezvoltarea țesuturilor adipoase, nu putem exclude faptul că tampoanele de grăsime epididimă, dar niciun alt depozit nu a atins dezvoltarea maximă atât la șoareci de tip sălbatic, cât și la șoareci ERK1 -/- nu s-a observat nicio diferență de aport alimentar între șoarecii ERK1 -/- și ERK1 +/+ pe o dietă bogată în grăsimi (datele nu sunt prezentate).

Dieta bogată în grăsimi este frecvent asociată cu rezistența la insulină. Așa cum era de așteptat, dieta bogată în grăsimi a condus la hiperglicemie la animalele de tip sălbatic hrănite (246 ± 43 față de 171 ± 15 mg/dl la dieta bogată în grăsimi vs. dieta normală, respectiv; P = 0,01). În schimb, șoarecii ERK1 -/- hrăniți nu au dezvoltat hiperglicemie (168 ± 13 vs. 196 ± 25 mg/dl pentru dieta bogată în grăsimi vs. dieta normală, respectiv; P = 0,1). Șoarecii mutanți și de control de post nu au dezvoltat hiperglicemie și nu s-a găsit nicio diferență în ceea ce privește trigliceridele și acizii grași liberi în ambele grupuri în regim normal sau bogat în grăsimi (Tabelul 1). Am determinat apoi sensibilitatea la insulină a animalelor, am efectuat un test de toleranță la glucoză și am efectuat un test de toleranță la insulină. Șoarecii de tip sălbatic din dietă bogată în grăsimi au devenit intoleranți la glucoză, un defect care nu a apărut la animalele ERK1 -/- (Fig. 3C). În mod similar, testul de toleranță la insulină a demonstrat rezistență severă la insulină doar la șoareci de tip sălbatic, pe o dietă bogată în grăsimi (Fig. 3D). În total, rezultatele noastre arată că dizabilitatea ERK1 protejează de obezitatea indusă de grăsimi și de intoleranța la glucoză.

Șoarecii ERK1 -/- au termogeneză postprandială mai mare.

Am explorat apoi activitatea și cheltuielile de energie la șoareci ERK1 -/-. Nu s-a observat nicio diferență în activitatea spontană la ERK1 -/- comparativ cu șoarecii de tip sălbatic ERK1 (datele nu sunt prezentate). În condiții de post, nu am observat nicio diferență semnificativă în rata metabolică bazală la șoarecii ERK1 -/- în comparație cu animalele de tip sălbatic (Fig. 4A). RQ bazal a fost identic în ambele grupuri (Fig. 4B), indicând faptul că raportul dintre glucoză și lipide utilizate pentru alimentarea metabolismului bazal a fost același la șoarecii mutanți și la șoarecii martor. Am investigat apoi răspunsul termogen la o masă de test calibrată (1 g) la șoareci. Șoarecii ERK1 -/- au prezentat o creștere postprandială mai mare a ratei metabolice, precum și a RQ (Fig. 4A și B), RQ mai mare indicând faptul că răspunsul termogen crescut la hrănire a fost alimentat de o rată crescută de oxidare a glucozei (datele nu sunt afișate). Prin urmare, se poate extrapola că, în condiții standard (hrănire ad libitum), cheltuielile de energie pot fi semnificativ mai mari la șoarecii ERK1 -/-, ceea ce poate contribui la rezistența la obezitate indusă de dietă bogată în grăsimi.

ERK1 -/- celulele au afectat adipogeneza.

Adipogeneza afectată poate fi cauzată fie de o scădere a numărului de precursori ai adipocitelor, fie de un defect al diferențierii terminale. Pref-1 este un inhibitor al diferențierii și un marker specific de preadipocite care nu este exprimat în adipocite mature (19-21). Prin urmare, presupunem că nivelul expresiei Pref-1, investigat la fibroblastele și preadipocitele embrionului de șoarece înainte de diferențiere, este o reflectare directă a grupului de precursori adipogeni. Am analizat expresia acestuia în fibroblaste de embrioni de șoarece și celule ale fracției vasculare stromale înainte de diferențiere și, de asemenea, în țesutul adipos alb. Interesant, comparativ cu martorul, expresia Pref-1 a scăzut semnificativ în celulele și țesuturile ERK1 -/- (Fig. 5G). Acest rezultat sugerează că adipogeneza afectată observată în celulele ERK1 -/- poate rezulta dintr-o reducere a rezervei de preadipocite.

ERK1 nu este necesar pentru proliferarea celulelor, dar este necesar în mod specific pentru diferențierea adipocitelor.

Am investigat apoi rolul izoformei ERK2 în diferențierea adipocitelor. Deoarece dizabilitatea ERK2 are ca rezultat moartea embrionară timpurie (ziua embrionară 6.5-8.5), evitându-se astfel izolarea fibroblastelor embrionilor de șoarece (10,11), am analizat efectul adăugării U0126 asupra fibroblastelor embrionului de șoarece sălbatic și asupra adipocitului rezidual diferențierea în celulele ERK1 -/-. U0126 a condus la o inhibare de 45% a adipogenezei la fibroblastele embrionilor de șoareci de tip sălbatic, care este identică cu scăderea adipogenezei observată în celulele knockout. Important, inhibitorul căii ERK nu a afectat în mod semnificativ formarea reziduală de adipocite a celulelor ERK1 -/- (Fig. 6C). Prin urmare, deși prezintă încă 80% din activitatea totală ERK, celulele ERK1 -/- au afectat adipogeneza, iar adăugarea U0126 nu a avut niciun efect asupra acestei adipogeneze. Aceste rezultate sugerează că ERK1 joacă un rol specific în adipogeneză, în timp ce izoforma ERK2 nu este implicată. Acesta din urmă este necesar pentru proliferarea celulelor după confluență, un proces care nu este implicat în diferențierea adipocitelor acestor celule (Fig. 6B).

Deoarece șoarecii cu deficiență c-iunie NH2-terminal 1 (JNK1) sunt rezistenți la dezvoltarea obezității în dieta bogată în grăsimi (24), am stabilit dacă calea JNK interferează cu diferențierea adipocitelor prin tratarea celulelor cu inhibitorul specific JNK SP600125 . Am constatat că inhibitorul nu a afectat formarea adipocitelor atât în ​​fibroblastele embrionului de tip sălbatic, cât și în cel al ERK1 -/- șoarece (Fig. 6C). Astfel, acest rezultat sugerează că calea JNK nu este necesară pentru diferențierea optimă a adipocitelor. Într-adevăr, nu a fost descrisă nicio dovadă a afectării adipogenezei la animalele JNK1 -/- (24). De asemenea, am constatat că JNK nu este implicat în stadiile incipiente ale diferențierii adipocitelor (9).

DISCUŢIE

ERK1 și -2 au o identitate totală de 75% la nivel de aminoacizi și sunt activate de aceiași stimuli. Cu toate acestea, spre deosebire de șoarecii ERK1 -/-, animalele knockout ERK2 nu sunt viabile, sugerând că cele două izoforme au funcții biologice distincte și nu sunt redundante (10-12). În ceea ce privește diferențierea adipocitelor, expunerea fibroblastelor embrionilor de șoarece la mediul diferențiator activează în mod egal ambele izoforme, așa cum se observă în liniile celulare de preadipocite 3T3-L1 (8). Aici, arătăm că dizabilitatea ERK1 nu modifică creșterea celulară, în timp ce inhibarea ERK2 blochează proliferarea celulelor ERK1 -/-. Prin contrast, inhibarea ERK2 nu afectează în continuare adipogeneza reziduală observată în celulele cu deficit de ERK1. Prin urmare, prin dezvăluirea faptului că deficitul de ERK1 afectează în mod specific diferențierea adipocitelor, în timp ce ERK2 este necesar pentru proliferare, rezultatele noastre se extind la adipogeneză noțiunea de funcții biologice distincte pentru cele două gene. Baza moleculară pentru astfel de activități divergente nu este încă înțeleasă. O ipoteză este că ERK1 ar putea avea substraturi preferențiale implicate în adipogeneză.

Arătăm aici că defectul observat in vitro se corelează cu adipozitatea redusă observată la șoarecii ERK1 -/-. Interesant, spre deosebire de alte țesuturi examinate în care activitatea ERK1 este mai slabă decât ERK2, în țesuturile adipoase albe ERK1 și -2 sunt activate la același nivel, sugerând un rol important pentru această izoformă. Conform acestei observații, șoarecii deficienți în ERK1 au adipozitate redusă și mai puține adipocite decât animalele de tip sălbatic. Mai mult, în ceea ce privește fibroblastele embrionilor preadipocitari și de șoarece, nu am observat nicio expresie compensatorie a ERK2 în țesutul adipos ERK1 (/ datele nu sunt prezentate). Recent, mai multe studii au arătat că țesutul adipos conține celule stem pluripotente (26-31) și validează conceptul că recrutarea de noi adipocite din celulele stem are loc de la naștere până la etapa adultă. Țesuturile și celulele adipoase albe din fracțiunea vasculară stromatică a animalelor ERK1 -/- au expresie redusă a markerului preadipocit Pref-1. Acest lucru sugerează că, așa cum sa observat in vitro, rezerva de preadipocite este diminuată și că ERK1 este necesară în primele etape ale adipogenezei in vivo.

Obezitatea se caracterizează prin hipertrofie și hiperplazie a adipocitelor, iar celulele noi sunt recrutate prin diferențierea adipocitelor. Dieta bogată în grăsimi induce o activare puternică a căii ERK, în special în țesutul adipos alb și nu în alte țesuturi. Această activare este necesară pentru dezvoltarea obezității, deoarece am constatat că animalele ERK1 -/- sunt puternic rezistente la obezitatea indusă de o dietă bogată în grăsimi. Prin urmare, defectul observat în dezvoltarea țesutului adipos alb al acestor animale poate fi suficient pentru a le proteja parțial de obezitate.

Am arătat în acest studiu că metabolismul bazal pe șoarece nu a fost diferit între șoarecii mutanți și șoarecii martor. Mai mult, am constatat că răspunsul termogen la ingestia unei mese a fost mai mare la șoarecii ERK1 -/-, ceea ce poate contribui, pe lângă adipogeneza afectată, la o rezistență la obezitate. De asemenea, am demonstrat că răspunsul termogen crescut la hrănire a fost alimentat de o rată crescută de oxidare a glucozei. S-a demonstrat că termogeneza crescută indusă de masă poate rezulta dintr-o sensibilitate mai mare la insulină în țesuturile periferice (32-34), ducând la o oxidare crescută a glucozei. Aceste date sunt astfel în acord cu sensibilitatea mai bună la insulină observată la șoarecii mutanți.

În concluzie, rezultatele noastre leagă în mod clar dizabilitatea ERK1 de adipozitatea redusă și rezistența la dieta bogată în grăsimi - obezitate indusă de cauza diferențierii afectate a adipocitelor și a metabolismului postprandial mai ridicat. Mai mult, am identificat funcții specializate și separate pentru cele două izoforme: ERK1 în diferențierea adipocitelor și ERK2 în proliferarea fibroblastelor embrionilor de șoarece. Vor fi necesare studii suplimentare pentru a înțelege, la nivel molecular, căile divergente dintre cele două kinaze la nivelul substraturilor lor. Datele noastre sugerează că vizarea specifică a izoformei ERK1 și nu a ERK2 ar fi de un interes deosebit pentru combaterea obezității și a rezistenței la insulină.