Abstract

fundal

Ixodes spp. sunt vectori ai agenților patogeni zoonotici. Toate cele trei etape active ale vieții (larve, nimfe, adulți) trebuie să se hrănească cu o gazdă pentru a se dezvolta. De obicei căpușele parazitează atașate la suprafața exterioară a pielii gazdelor lor. Interesant este că, în unele cazuri, căpușele pot fi găsite și în țesutul subcutanat într-o varietate de gazde, cum ar fi vulpile roșii (Vulpes vulpes), câini ratonNyctereutes procyonoides) și câini.

Metode

Partea viscerală a 126 de blănuri de vulpe roșie din Germania a fost examinată vizual căutând căpușe. Localizarea căpușelor a fost înregistrată și atribuită la zece părți specifice ale corpului. Identificarea morfologică a căpușelor a fost efectuată conform protocoalelor taxonomice standardizate. Căpușele care nu au putut fi identificate în continuare au fost examinate genetic prin intermediul PCR convențional care vizează 16S ARNr și cox1 genă. Colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E) a fost folosită pentru examenul histopatologic.

Rezultate

În 111 din 126 (88,1%) straturi examinate, cel puțin o căpușă a fost găsită în țesutul subcutanat. Un total de 1203 căpușe au fost îndepărtate din țesutul subcutanat. Căpușele bine conservate ar putea fi identificate pe baza criteriilor morfologice, dar majoritatea căpușelor se aflau într-o stare progresivă de descompunere. Aici, identificarea speciilor morfologice nu a avut succes. De asemenea, metodele PCR nu au condus la identificarea cu succes a speciilor. Următoarele specii și etape de dezvoltare au fost găsite prin identificare morfologică: Ixodes ricinus (Femeie, n = 289; masculin, n = 8; nimfă, n = 1), I. hexagon (Femeie, n = 2), I. canisuga (Femeie, n = 1). Masculin I. ricinus au fost găsite individual sau copulând în perechi cu femele. Căpușele subcutanate au fost localizate la trei părți ale corpului afectate predominant: urechi, regiune axilară și inghinală. Examenul histologic al căpușelor subcutanate a evidențiat o paniculită granulomatoasă.

Concluzii

Din cunoștințele autorilor, aceasta este prima constatare a căpușelor subcutanate foarte răspândite la vulpile roșii din Germania. Localizarea subcutanată a căpușelor pare a fi foarte frecventă la vulpile roșii și la regulă, mai degrabă decât la excepție. Incorporarea profundă a longirostrei și timpul lung de hrănire a femelelor par să favorizeze localizarea subcutanată. Majoritatea vulpilor au fost infestate în zona inghinală, unde pielea este subțire și mai puțin păroasă.

ixodes

fundal

Căpușe aparținând genurilor Ixodes și Dermacentor (Familia: Ixodidae) sunt cele mai răspândite în Europa [1]. Toate etapele de viață activă a căpușelor (larva cu șase picioare, nimfa cu opt picioare și femele) necesită mese de sânge de la gazde pentru mutare (imaturi) sau pentru ovipoziție (femele), cu excepția masculilor care se hrănesc facultativ și sunt localizați pe gazde, în special pentru împerechere scopuri [1, 2].

În Germania specia Ixodes ricinus, I. hexagon, I. canisuga și I. kaiseri au fost frecvent colectate de la vulpi [3,4,5,6,7,8]. În plus, Dermacentor reticulatus și Haemaphysalis concinna s-au găsit ocazional atașați de pielea vulpilor roșii [7, 9]. Căpușele sunt de obicei atașate puternic de suprafața exterioară a gazdelor lor pentru a rămâne la locul lor pentru o masă de sânge. Prin urmare, piesele bucale ale căpușelor pătrund în diferite straturi ale pielii, în funcție de lungimea lor. Căpușe cu piese bucale lungi (longirostra de ex. Amblyomma, Hialomma și Ixodes) încorporat în straturi adânci ale dermei în timp ce căpușele cu părți bucale scurte (brevirostra de ex. Dermacentor, Haemaphysalis și Rhipicephalus) abia pătrund în epidermă [10, 11]. Ixodes ricinus larvele sunt atașate timp de 2-4 zile, nimfele timp de 4-6 zile și femelele timp de 6-10 zile [12].

Interesant este că, în unele cazuri, căpușele pot fi găsite și în țesutul subcutanat într-o varietate de gazde, inclusiv vulpile roșii. Prezența căpușelor subcutanate, cum ar fi I. ricinus, I. hexagon, I. crenulatus și D. reticulatus a fost remarcat la vulpile roșii în mai multe studii de caz din Marea Britanie, Polonia, Austria, România, Slovacia și Republica Cehă [13,14,15,16,17,18,19,20]. În SUA, specia nativă de căpușe Amblyomma americanum a fost, de asemenea, descoperit în țesutul subcutanat al vulpilor roșii [21].

În afară de vulpile roșii, rapoartele de caz unic de căpușe subcutanate au fost înregistrate anterior la câinii raton (Nyctereutes procyonoides) din Polonia [22], la un câine din Suedia [23] și la un copil din Coreea de Sud [24].

Până în prezent, dimensiunile mici ale eșantioanelor au fost raportate în majoritatea cazurilor, de asemenea, mai degrabă ca rezultate ocazionale [13,14,15,16,17, 21]. Până în prezent, nu există date publicate despre căpușele subcutanate la vulpile roșii sau alte animale din Germania. Acesta este motivul pentru care acest studiu își propune să evalueze frecvența căpușelor subcutanate la vulpile roșii din Germania folosind un număr mare de probe. Localizarea căpușelor subcutanate în diferite regiuni ale corpului vulpii roșii nu a fost încă analizată; prin urmare, am documentat localizarea fiecărei căpușe pentru a determina abundența acestor căpușe în țesutul subcutanat. Identificarea precisă a speciilor de căpușe subcutanate pe baza criteriilor morfologice este posibilă numai într-o măsură limitată datorită procesului avansat de degradare în țesutul subcutanat, așa cum s-a văzut în studiile anterioare [18]. Prin urmare, acest studiu își propune să utilizeze tehnici de biologie moleculară pentru a identifica căpușe subcutanate la nivelul speciilor.

Metode

Colectarea animalelor

În perioada noiembrie 2018 - februarie 2019 vânătorii locali au împușcat vulpi roșii și alte vânate sălbatice într-un curs de vânătoare tradițională. În cooperare cu o stație de răzuire (Fellwechsel Berlin, Germania), vânătorii locali din toată Germania au depus carcase de vulpe în pungi de plastic etichetate cu data și locația geografică exactă în congelatoare. Doar vulpile adulte cu stare nutrițională bună au fost selectate de vânătoare. Cadavrele de vulpe au fost depozitate la - 80 ° C până la descuamare. Pentru a permite studiile histologice, o vulpe a fost jupuită direct după vânătoare.

Colectarea și identificarea căpușelor

Partea viscerală a fiecărei blănuri a fost examinată vizual pentru prezența căpușelor subcutanate. Localizarea căpușelor a fost înregistrată pe o imagine schematică pre-desenată și atribuită la zece părți specifice ale corpului (urechi, gât, regiunea axilară, umăr, spate, burtă, regiune inghinală, regiune anorectală, picioare și coadă) pentru a crea un corp harta densității căpușelor (Fig. 1), după cum recomandă Lydecker și colab. [25]. Ulterior, căpușele au fost disecate individual din țesutul subcutanat cu o forceps cu vârf fin și un bisturiu și depozitate la - 20 ° C (Fig. 2). Căpușele bine conservate ar putea fi identificate pe baza criteriilor morfologice în conformitate cu protocoalele taxonomice standardizate [26] sub un binoclu la mărire de 50 × (Motic SMZ-171, Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Germania).

Densitatea căpușelor exprimată ca procent din numărul total de căpușe în funcție de regiunea corpului (n = 111 vulpi roșii). Un gri mai închis din figură indică o densitate mai mare de căpușe

Vizualizare macroscopică a căpușelor cu localizare subcutanată. A O căpușă ridicată cu o pensetă cu vârfuri fine și alte căpușe în țesutul înconjurător. b Căpușe în stadii avansate de descompunere. c Căpușe bine conservate în dorsal (săgeată neagră) și pozitiv ventral (săgeată roșie)

Extracție ADN și metode PCR

Căpușele care nu au putut fi identificate morfologic au fost procesate ulterior prin PCR convențional pentru a le identifica la nivelul speciilor. Pentru extracția ADN-ului, s-au adăugat 1 g de margele de oțel (de 2,8 mm) și 500 pl de PBS la fiecare căpușă. Probele au fost apoi omogenizate la 5000 × rpm pentru 2 × 15 s cu intervale de pauză de 15 s într-un omogenizator tisular Precellys®24 (Bertin Technologies, Montigny Le Bretonneux, Franța).

ADN-ul genomic a fost extras folosind QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania) urmând instrucțiunile producătorului. Amplificări PCR ale citocromului parțial c subunitatea oxidază 1 (cox1) gena (710 pb) și a 16S genele acidului ribonucleic ribozomal (ARNr) (455 bp) au fost efectuate folosind protocoalele PCR publicate anterior [8, 27]. Produsele PCR au fost vizualizate prin electroforeză pe gel pe geluri de agaroză 2% colorate cu HDGreen Plus DNA Stain (Intas Science Imaging Instruments GmbH, Göttingen, Germania).

Examen histologic al țesutului subcutanat

analize statistice

Intervalele de încredere (IC 95%) pentru ratele de prevalență a căpușelor subcutanate și stadiul lor de viață au fost determinate de metoda Clopper & Pearson cu GraphPad Software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA). Testul U Mann-Whitney cu un nivel de semnificație de α = 0,05 a fost utilizat pentru a compara diferitele regiuni ale corpului. Independența eșantioanelor mici comparate (n

Rezultate

Colectarea animalelor

Pentru studiul de față, au fost colectate și examinate 126 de vulpi roșii (75 de bărbați și 51 de femele) din centralele [statelor federale Brandenburg (n = 1); Hesse (n = 2); Renania de Nord-Westfalia (COM)n = 56): Saxonian = 3); și Turingia (n = 5)] și nordul Germaniei [statele federale Saxonia Inferioară (n = 45); și Schleswig-Holstein (n = 14)].

Colectarea căpușelor

În 111 din 126 (88,1%, IC 95%: 81,13-93,18%) straturi examinate, cel puțin o căpușă a fost găsită în țesutul subcutanat. Frecvența apariției căpușelor subcutanate între vulpile masculine și feminine nu a diferit semnificativ (P FIG. 3

Distribuția sarcinii căpușelor a diferit între 1 și 79, un total de 1203 căpușe putând fi eliminate. Majoritatea vulpilor au fost infestate cu un număr mic de căpușe

Localizarea subcutanată a căpușelor

Căpușele subcutanate au fost localizate la toate cele 10 părți ale corpului definite. În mod semnificativ, cele mai multe căpușe au fost găsite în zona inghinală comparativ cu toate celelalte regiuni ale corpului (U(2268) = 262431,00, Z = - 26.629, P Tabelul 2 În majoritatea blănurilor de vulpe căpușe subcutanate au fost găsite în mai multe regiuni ale corpului. Dar în mod semnificativ majoritatea vulpilor au fost infestate în regiunea inghinală într-o comparație directă asociată cu toate celelalte regiuni ale corpului

Studii histologice ale țesutului subcutanat

În total, 23 de căpușe subcutanate colectate de la o vulpe au fost examinate histologic (Fig. 4). O singură căpușă a fost alocată categoriei 1, 11 au aparținut categoriei 2 și 11 categoriei 3. Căpușele categoriei 1 au fost înconjurate de o inflamație moderată granulomatoasă a țesutului adipos subcutanat (panniculită) format din histiocite, macrofage, celule gigantice multinucleare și eozinofile . Neutrofilele au fost observate doar ocazional. Un răspuns inflamator dermic ușor a fost prezent cu exocitoza ușoară a celulelor inflamatorii în epidermă. Histiocitele, macrofagele și eozinofilele au fost cele mai frecvente celule observate. În plus, s-au găsit edeme epidermice inter- și intracelulare moderate și hiperkeratoză ortokeratotică lamelară moderată. Au fost prezente pustule intradermice și intracorneale umplute în principal cu neutrofile și rareori cu macrofage.

Un grad ridicat de deformare a căpușelor a fost vizibil în majoritatea secțiunilor histologice. Prezența căpușelor din categoria 2 a dus la o paniculită granulomatoasă ușoară compusă din histiocite, macrofage, celule gigantice multinucleare, eozinofile și neutrofile rare.

În partea interioară a căpușelor din categoria 1 și 2 nu s-a putut identifica țesut moale al artropodului și nu au fost recunoscute structuri celulare. Exoscheletul rupt de căpușe aparținând categoriei 3 a fost umplut cu un infiltrat de celule inflamatorii mixte format din histiocite, macrofage și celule gigant multinucleare. Aceste căpușe au fost înconjurate de o paniculită granulomatoasă severă, fără modificări inflamatorii ale dermului și epidermei.

Examenul histologic al căpușelor cu țesut și piele înconjurătoare a confirmat localizarea subcutanată. S-a observat creșterea inflamației granulomatoase eozinofile de la categoria 1 la 3. În timpul examinării histopatologice nu s-au observat produse de degradare a sângelui.

Discuţie

Vulpile sunt gazde importante pentru o varietate de endo- și ectoparaziți și, prin urmare, rezervoare pentru agenții patogeni și zoonozele animalelor [28]. Prevalența observată a căpușelor subcutanate (88,1%) în prezentul studiu este mai mare decât în ​​Polonia (38%) [20] și Republica Cehă/România (15,4%) [18]. Mai mult, prevalența căpușelor subcutanate este mai mare în comparație cu prevalența căpușelor externe la vulpile roșii din Italia (7,4%) [29] și România (53,9%) [30], dar coincide cu studiile din Spania (51,1-84,6%) [ 31,32,33] și Germania (76,5-82,6%) [7, 34]. În plus, intensitatea infestării căpușelor subcutanate (medie = 10,8) în prezentul studiu este similară cu căpușele externe dintr-un alt studiu care examinează 1268 vulpi în Germania (medie = 11,7) [34]. În acest studiu, 50,9% dintre vulpi au fost infestate cu maximum 5 căpușe pe suprafața lor externă, în timp ce în studiul de față 43,2% dintre vulpi au fost infestate cu maximum 5 căpușe. Cu toate acestea, în unele cazuri, atât căpușele subcutanate, cât și cele externe au fost colectate numeric de la câteva vulpi (3,6-5,7%) cu mai mult de 50 de căpușe pe vulpe [7].

În Europa, mai multe căpușe ale genurilor Ixodes, Dermacentor, Haemaphysalis, Hialomma și Rhipicephalus se știe că parazitează vulpile roșii [7, 8, 29, 31, 32]. În Germania, I. ricinus, I. hexagon, I. canisuga și I. kaiseri au fost de obicei colectate de la vulpi, în timp ce D. reticulatus și H. concinna au fost găsite ocazional [7, 9]. În consecință, am găsit trei dintre speciile longirostrale menționate anterior (I. ricinus, I. hexagon și I. canisuga) în țesutul subcutanat. De asemenea, datele publicate anterior din SUA și Republica Cehă/România arată diferențele regionale ale speciilor de căpușe în țesutul subcutanat, în funcție de fauna predominantă a căpușelor [18, 20, 21].

Longirostra (de ex. Amblyomma, Hialomma și Ixodes) încorporați mai adânc pe pielea gazdelor în comparație cu brevirostra (de ex. Dermacentor, Haemaphysalis și Rhipicephalus) care se atașează mai superficial [10, 11]. În studiul actual, exclusiv Ixodes căpușele au fost colectate din țesutul subcutanat al vulpilor. Aceste descoperiri sunt în concordanță cu înregistrările publicate ale căpușelor subcutanate, unde Ixodes căpușele au dominat Dermacentor spp. care au fost găsite doar ocazional [18, 20]. Încorporarea profundă (ca și în longirostra) a fost discutată anterior ca fiind favorabilă localizării subcutanate a căpușelor [18]. Descoperirile noastre sunt în concordanță cu această ipoteză, deoarece longirostra a fost semnificativ mai des găsită subcutanat în comparație cu brevirostra.

Perioada de hrănire a căpușelor ixodide depinde de stadiul de dezvoltare al căpușei și variază între câteva zile (imaturi) până la două săptămâni (femele) [12]. D’Amico și colab. [18] a subliniat că o durată lungă de hrănire pune căpușe în favoarea găsirii în țesutul subcutanat. În acord cu acest lucru, s-au găsit semnificativ mai multe femele subcutanate (97,0%; P

Concluzii

Localizarea subcutanată a căpușelor pare a fi foarte frecventă la vulpile roșii și este mai degrabă regula decât excepția. Acestea erau localizate în principal la părțile corpului vulpii mai puțin păroase, subțiri și pliate. Locația neobișnuită a căpușelor nu este legată de o specie de căpușă sau de un stadiu de dezvoltare, totuși au fost găsite în principal longirostre feminine. Factorii decisivi pentru localizarea subcutanată a căpușelor par a fi încastrarea profundă a longirostrei și durata lungă de atașare a femelelor. Au fost necesare examinări suplimentare pentru a evalua mecanismul care duce la localizarea subcutanată a căpușelor. Cu toate acestea, acest fenomen nu este un avantaj evolutiv pentru căpușe, deoarece toate căpușele colectate erau moarte și în diferite stadii de descompunere.

Disponibilitatea datelor și a materialelor

Datele care susțin concluziile acestui articol sunt incluse în articol. Datele brute utilizate și/sau analizate în timpul prezentului studiu sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă.