Maja Haut

1 Institutul de igienă animală și sănătate publică veterinară, Facultatea de Medicină Veterinară, Universitatea din Leipzig, An den Tierkliniken 1, 04103 Leipzig, Germania

Nina Król

1 Institutul de igienă animală și sănătate publică veterinară, Facultatea de Medicină Veterinară, Universitatea din Leipzig, An den Tierkliniken 1, 04103 Leipzig, Germania

Anna Obiegala

1 Institutul de igienă animală și sănătate publică veterinară, Facultatea de Medicină Veterinară, Universitatea din Leipzig, An den Tierkliniken 1, 04103 Leipzig, Germania

Johannes Seeger

2 Institutul de Anatomie, Histologie și Embriologie, Facultatea de Medicină Veterinară, Universitatea din Leipzig, An den Tierkliniken 43, 04103 Leipzig, Germania

Martin Pfeffer

1 Institutul de igienă animală și sănătate publică veterinară, Facultatea de Medicină Veterinară, Universitatea din Leipzig, An den Tierkliniken 1, 04103 Leipzig, Germania

Date asociate

Datele care susțin concluziile acestui articol sunt incluse în articol. Datele brute utilizate și/sau analizate în timpul prezentului studiu sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă.

Abstract

fundal

Ixodes spp. sunt vectori ai agenților patogeni zoonotici. Toate cele trei etape active ale vieții (larve, nimfe, adulți) trebuie să se hrănească cu o gazdă pentru a se dezvolta. De obicei căpușele parazitează atașate la suprafața exterioară a pielii gazdelor lor. Interesant este că, în unele cazuri, căpușele pot fi găsite și în țesutul subcutanat într-o varietate de gazde, cum ar fi vulpile roșii (Vulpes vulpes), câinii raton (Nyctereutes procyonoides) și câinii.

Metode

Latura viscerală a 126 de blănuri de vulpe roșie din Germania a fost examinată vizual căutând căpușe. Localizarea căpușelor a fost înregistrată și atribuită la zece părți specifice ale corpului. Identificarea morfologică a căpușelor a fost efectuată conform protocoalelor taxonomice standardizate. Căpușele care nu au putut fi identificate în continuare au fost examinate genetic prin PCR convențional care vizează ARNr 16S și gena cox1. Colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E) a fost folosită pentru examenul histopatologic.

Rezultate

În 111 din 126 (88,1%) straturi examinate, cel puțin o căpușă a fost găsită în țesutul subcutanat. Un total de 1203 căpușe au fost îndepărtate din țesutul subcutanat. Căpușele bine conservate ar putea fi identificate pe baza criteriilor morfologice, dar majoritatea căpușelor se aflau într-o stare progresivă de descompunere. Aici, identificarea speciilor morfologice nu a avut succes. De asemenea, metodele PCR nu au condus la identificarea cu succes a speciilor. Următoarele specii și etape de dezvoltare au fost găsite prin identificare morfologică: Ixodes ricinus (femelă, n = 289; mascul, n = 8; nimfă, n = 1), I. hexagonus (femelă, n = 2), I. canisuga (femelă, n = 1). Mascul I. ricinus a fost găsit individual sau copulând în perechi cu femele. Căpușele subcutanate au fost localizate la trei părți ale corpului afectate predominant: urechi, regiunea axilară și inghinală. Examenul histologic al căpușelor subcutanate a evidențiat o paniculită granulomatoasă.

Concluzii

Din cunoștințele autorilor, aceasta este prima constatare a căpușelor subcutanate foarte răspândite la vulpile roșii din Germania. Localizarea subcutanată a căpușelor pare a fi foarte frecventă la vulpile roșii și la regulă, mai degrabă decât la excepție. Incorporarea profundă a longirostrei și perioadele lungi de hrănire a femelelor par să favorizeze localizarea subcutanată. Majoritatea vulpilor au fost infestate în zona inghinală, unde pielea este subțire și mai puțin păroasă.

bifează

fundal

Căpușele aparținând genurilor Ixodes și Dermacentor (Familia: Ixodidae) sunt cele mai răspândite în Europa [1]. Toate etapele de viață activă a căpușelor (larva cu șase picioare, nimfa cu opt picioare și femele) necesită mese de sânge de la gazde pentru mutare (imaturi) sau pentru ovipoziție (femele), cu excepția masculilor care se hrănesc facultativ și sunt localizați pe gazde, în special pentru împerechere scopuri [1, 2].

În Germania, speciile Ixodes ricinus, I. hexagonus, I. canisuga și I. kaiseri au fost colectate frecvent de la vulpi [3-8]. În plus, Dermacentor reticulatus și Haemaphysalis concinna s-au găsit ocazional atașate de pielea vulpilor roșii [7, 9]. Căpușele sunt de obicei atașate puternic de suprafața exterioară a gazdelor lor pentru a rămâne la locul lor pentru o masă de sânge. Prin urmare, piesele bucale ale căpușelor pătrund în diferite straturi ale pielii, în funcție de lungimea lor. Căpușele cu piese bucale lungi (longirostra, de exemplu, Amblyomma, Hyalomma și Ixodes) încorporate în straturi adânci ale dermei, în timp ce căpușele cu piese bucale scurte (brevirostra, de exemplu, Dermacentor, Haemaphysalis și Rhipicephalus) abia pătrund în epidermă [10, 11]. Larvele Ixodes ricinus sunt atașate timp de 2-4 zile, nimfele timp de 4-6 zile și femelele timp de 6-10 zile [12].

Interesant este că, în unele cazuri, căpușele pot fi găsite și în țesutul subcutanat într-o varietate de gazde, inclusiv vulpile roșii. Prezența căpușelor subcutanate precum I. ricinus, I. hexagonus, I. crenulatus și D. reticulatus a fost observată la vulpile roșii în mai multe studii de caz din Marea Britanie, Polonia, Austria, România, Slovacia și Republica Cehă [13-20] . În SUA, specia nativă de căpușe Amblyomma americanum a fost, de asemenea, descoperită în țesutul subcutanat al vulpilor roșii [21].

În afară de vulpi roșii, rapoartele unui singur caz de căpușe subcutanate au fost înregistrate anterior la câinii raton (Nyctereutes procyonoides) din Polonia [22], la un câine din Suedia [23] și la un copil din Coreea de Sud [24].

Până în prezent, dimensiunile mici ale eșantioanelor au fost raportate în majoritatea cazurilor, de asemenea, mai degrabă ca rezultate ocazionale [13-17, 21]. Până în prezent, nu există date publicate despre căpușele subcutanate la vulpile roșii sau alte animale din Germania. Acesta este motivul pentru care acest studiu își propune să evalueze frecvența căpușelor subcutanate la vulpile roșii din Germania folosind un număr mare de probe. Localizarea căpușelor subcutanate în diferite regiuni ale corpului vulpii roșii nu a fost încă analizată; prin urmare, am documentat localizarea fiecărei căpușe pentru a determina abundența acestor căpușe în țesutul subcutanat. Identificarea precisă a speciilor de căpușe subcutanate pe baza criteriilor morfologice este posibilă numai într-o măsură limitată datorită procesului avansat de degradare în țesutul subcutanat, așa cum s-a văzut în studiile anterioare [18]. Prin urmare, acest studiu își propune să utilizeze tehnici de biologie moleculară pentru a identifica căpușe subcutanate la nivelul speciilor.

Metode

Colectarea animalelor

În perioada noiembrie 2018 - februarie 2019 vânătorii locali au împușcat vulpi roșii și alte vânate sălbatice într-un curs de vânătoare tradițională. În cooperare cu o stație de răzuire (Fellwechsel Berlin, Germania), vânătorii locali din toată Germania au depus carcase de vulpe în pungi de plastic etichetate cu data și locația geografică exactă în congelatoare. Doar vulpile adulte cu stare nutrițională bună au fost selectate de vânătoare. Cadavrele de vulpe au fost depozitate la - 80 ° C până la descuamare. Pentru a permite studiile histologice, o vulpe a fost jupuită direct după vânătoare.

Colectarea și identificarea căpușelor

Partea viscerală a fiecărei blănuri a fost examinată vizual pentru prezența căpușelor subcutanate. Localizarea căpușelor a fost înregistrată pe o imagine schematică pre-desenată și atribuită la zece părți specifice ale corpului (urechi, gât, regiunea axilară, umăr, spate, burtă, regiune inghinală, regiune anorectală, picioare și coadă) pentru a crea un corp harta densității căpușelor (Fig. 1), după cum recomandă Lydecker și colab. [25]. Ulterior, căpușele au fost disecate individual din țesutul subcutanat cu o forceps cu vârf fin și un bisturiu și depozitate la - 20 ° C (Fig. 2). Căpușele bine conservate ar putea fi identificate pe baza criteriilor morfologice în conformitate cu protocoalele taxonomice standardizate [26] sub un binoclu la mărire de 50 × (Motic SMZ-171, Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Germania).

Densitatea căpușelor exprimată ca procent din numărul total de căpușe în funcție de regiunea corpului (n = 111 vulpi roșii). Un gri mai închis din figură indică o densitate mai mare de căpușe

Vizualizare macroscopică a căpușelor cu localizare subcutanată. A O căpușă ridicată cu o pensetă cu vârfuri fine și alte căpușe în țesutul înconjurător. b Căpușe în stadii avansate de descompunere. c Căpușe bine conservate în dorsal (săgeată neagră) și pozitiv ventral (săgeată roșie)

Extracție ADN și metode PCR

Căpușele care nu au putut fi identificate morfologic au fost procesate ulterior prin PCR convențional pentru a le identifica la nivelul speciilor. Pentru extracția ADN-ului, s-au adăugat 1 g de margele de oțel (de 2,8 mm) și 500 pl de PBS la fiecare căpușă. Probele au fost apoi omogenizate la 5000 × rpm timp de 2 × 15 s cu intervale de pauză de 15 s într-un omogenizator tisular Precellys®24 (Bertin Technologies, Montigny Le Bretonneux, Franța).

ADN-ul genomic a fost extras folosind QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania) urmând instrucțiunile producătorului. Amplificările PCR ale genei subunității 1 (cox1) parțial citocrom c oxidază (cox1) (710 bp) și ale genei 16S ribosomal ribonucleic acid (rRNA) (455 bp) au fost efectuate folosind protocoalele PCR publicate anterior [8, 27]. Produsele PCR au fost vizualizate prin electroforeză pe gel pe geluri de agaroză 2% colorate cu HDGreen Plus DNA Stain (Intas Science Imaging Instruments GmbH, Göttingen, Germania).

Examen histologic al țesutului subcutanat

analize statistice

Intervalele de încredere (IC 95%) pentru ratele de prevalență a căpușelor subcutanate și stadiul lor de viață au fost determinate de metoda Clopper & Pearson cu GraphPad Software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA). Testul U Mann-Whitney cu un nivel de semnificație α = 0,05 a fost utilizat pentru a compara diferitele regiuni ale corpului. Independența dimensiunilor mici ale eșantionului comparate (n 3). Un total de 1203 căpușe au fost îndepărtate din țesutul subcutanat. Caracteristicile morfologice ale Ixodidae, cum ar fi prezența unui scut dorsal sau a pieselor bucale atașate anterior și vizibile dorsal, au fost prezente la toate căpușele găsite. Cele mai multe căpușe (n = 902; 75%) au fost într-o stare progresivă de descompunere, iar stadiul de dezvoltare, precum și nivelul speciei nu au putut fi determinate. Cu toate acestea, au fost îndeplinite criterii specifice pentru a atribui căpușele familiei Ixodidae. În aceste cazuri, identificarea speciilor folosind metode biologice moleculare nu a avut succes. Căpușele bine conservate (n = 301; 25,0%) ar putea fi identificate la nivelul speciei pe baza criteriilor morfologice. S-au găsit următoarele specii și etape de dezvoltare (Tabelul 1): Ixodes ricinus (femelă, mascul, nimfă); I. hexagon (feminin); I. canisuga (femeie). Cel mai frecvent stadiu de viață au fost femeile (97,0%; n = 292/301, 95% CI: 94,40-98,62%), urmate de bărbați (2,7%; n = 8/301, 95% CI: 1,15-5,17%) și nimfe (0,3%; n = 1/301, 95% CI: 0,01-1,84%). Femelele au fost identificate cel mai frecvent ca I. ricinus (99,0%; n = 289/292, 95% CI: 97,03-99,79%). Toate căpușele masculine aparțineau lui I. ricinus și au fost găsite în principal ca perechi de împerechere cu femele (n = 6/8), dar și individual (n = 2/8).

Distribuția sarcinii căpușelor a diferit între 1 și 79, un total de 1203 căpușe putând fi eliminate. Majoritatea vulpilor au fost infestate cu un număr mic de căpușe

tabelul 1

Bifați speciile și etapele de viață ale căpușelor bine conservate găsite în țesutul subcutanat

Specii de căpușe Nu. de căpușe (%) Nr. de masculi Nu. de femele Nu. de nimfe
I. ricinus298 (99,0)82891
I. hexagon2 (0,7) 2
I. canisuga1 (0,3) 1
Total (%)301 (100)8 (2,7)292 (97,0)1 (0,3)

Localizarea subcutanată a căpușelor

Căpușele subcutanate au fost localizate la toate cele 10 părți ale corpului definite. În mod semnificativ, cele mai multe căpușe au fost găsite în zona inghinală comparativ cu toate celelalte regiuni ale corpului (U (2268) = 262431.00, Z = - 26.629, P 2). A doua și a treia regiune a corpului cele mai comune au fost zonele din jurul urechilor și axilei. În total, 80,2% (n = 964) din toate căpușele colectate au fost observate în aceste trei regiuni ale corpului (Fig. 1). Alte regiuni au prezentat o sarcină semnificativ mai mică a căpușelor subcutanate (U (5292) = 2072521,50, Z = - 30,909, P 4). O singură căpușă a fost alocată categoriei 1, 11 au aparținut categoriei 2 și 11 categoriei 3. Căpușele categoriei 1 au fost înconjurate de o inflamație moderată granulomatoasă a țesutului adipos subcutanat (panniculită) format din histiocite, macrofage, celule gigantice multinucleare și eozinofile . Neutrofilele au fost observate doar ocazional. Un răspuns inflamator dermic ușor a fost prezent cu exocitoza ușoară a celulelor inflamatorii în epidermă. Histiocitele, macrofagele și eozinofilele au fost cele mai frecvente celule observate. În plus, s-au găsit edeme epidermice inter- și intracelulare moderate și hiperkeratoză ortokeratotică lamelară moderată. Au fost prezente pustule intradermice și intracorneale umplute în principal cu neutrofile și rareori cu macrofage.

Un grad ridicat de deformare a căpușelor a fost vizibil în majoritatea secțiunilor histologice. Prezența căpușelor din categoria 2 a dus la o paniculită granulomatoasă ușoară compusă din histiocite, macrofage, celule gigantice multinucleare, eozinofile și neutrofile rare.

În partea interioară a căpușelor din categoria 1 și 2 nu s-a putut identifica țesut moale al artropodului și nu au fost recunoscute structuri celulare. Exoscheletul rupt de căpușe aparținând categoriei 3 a fost umplut cu un infiltrat de celule inflamatorii mixte format din histiocite, macrofage și celule gigant multinucleare. Aceste căpușe au fost înconjurate de o paniculită granulomatoasă severă, fără modificări inflamatorii ale dermului și epidermei.

Examenul histologic al căpușelor cu țesut și piele înconjurătoare a confirmat localizarea subcutanată. S-a observat creșterea inflamației granulomatoase eozinofile de la categoria 1 la 3. În timpul examinării histopatologice nu s-au observat produse de degradare a sângelui.

Discuţie

Vulpile sunt gazde importante pentru o varietate de endo- și ectoparaziți și, prin urmare, rezervoare pentru agenții patogeni și zoonozele animalelor [28]. Prevalența observată a căpușelor subcutanate (88,1%) în prezentul studiu este mai mare decât în ​​Polonia (38%) [20] și Republica Cehă/România (15,4%) [18]. Mai mult, prevalența căpușelor subcutanate este mai mare în comparație cu prevalența căpușelor externe la vulpile roșii din Italia (7,4%) [29] și România (53,9%) [30], dar coincide cu studiile din Spania (51,1-84,6%) [ 31-33] și Germania (76,5-82,6%) [7, 34]. În plus, intensitatea infestării căpușelor subcutanate (medie = 10,8) în prezentul studiu este similară cu căpușele externe dintr-un alt studiu care examinează 1268 vulpi în Germania (medie = 11,7) [34]. În acest studiu, 50,9% dintre vulpi au fost infestate cu maximum 5 căpușe pe suprafața lor externă, în timp ce în studiul de față 43,2% dintre vulpi au fost infestate cu maximum 5 căpușe. Cu toate acestea, în unele cazuri, atât căpușele subcutanate, cât și cele externe au fost colectate numeric de la câteva vulpi (3,6-5,7%) cu mai mult de 50 de căpușe pe vulpe [7].

În Europa, se știe că mai multe căpușe din genurile Ixodes, Dermacentor, Haemaphysalis, Hyalomma și Rhipicephalus parazitează vulpile roșii [7, 8, 29, 31, 32]. În Germania, I. ricinus, I. hexagonus, I. canisuga și I. kaiseri au fost colectate în mod obișnuit de la vulpi, în timp ce D. reticulatus și H. concinna au fost găsite ocazional [7, 9]. În consecință, am găsit trei dintre speciile longirostrale menționate anterior (I. ricinus, I. hexagonus și I. canisuga) în țesutul subcutanat. De asemenea, datele publicate anterior din SUA și Republica Cehă/România arată diferențele regionale ale speciilor de căpușe în țesutul subcutanat, în funcție de fauna predominantă a căpușelor [18, 20, 21].