Subiecte

Abstract

Introducere

Studiile de secvențiere metagenomică ale Proiectului Microbiomului Uman (HMP) au caracterizat complexitatea microbiomului uman în numeroase situri ale corpului, evidențiind diferențe semnificative între comunitățile microbiene din și între indivizi 1. La un adult sănătos, un raport de 10: 1 dintre celulele unui corp sunt 1,2 microbiene. Expeditor și colab. 3 au contestat această estimare și au sugerat că raportul este mult mai aproape de 1: 1. Thanatomicrobiomul este comunitatea microbiană postmortem a corpului uman, care implică un proces de succes în care trilioane de microbi locuiesc, proliferează și mor intern și extern în tot corpul mort, rezultând schimbări temporale ale compoziției comunității în timp 4.5. La moarte, mediul gazdă se modifică din cauza descompunerii celulelor și eliberarea ulterioară a componentelor celulare în țesuturile din jur. Există mai multe evenimente secvențiale care apar după moartea unei persoane, care duc la reproducerea dezinhibată a anumitor tipuri de celule microbiene și la starea sau moartea altor celule 6,7,8,9,10 .

Studiul thanatomicrobiomului organelor interne și al sângelui nu este direct influențat de aceiași factori abiotici de mediu (adică, pH și temperatură) și factori biotici (adică, insecte și activități de eliminare) 11 care sunt întâmpinați de necrobiom 12. În plus, se presupune că thanatomicrobiomul anumitor organe nu este imediat afectat de microorganismele asociate intestinului care proliferează rapid după moartea omului 13. A fost odată o credință îndelungată că organele interne umane erau sterile în gazdele vii 14.15. Cu toate acestea, există suficiente dovezi demonstrate prin datele HMP că unele organe interne (adică plămânii și intestinele) oferă nișe distincte pentru microorganismele comensale oportuniste și patogene pentru colonizarea microbiomilor 1. Microbii descoperiți în organele interne ale cadavrelor ar putea reprezenta pe cei asociați direct cu descompunerea umană. Tuomisto și colab. 13 au demonstrat că organele interne, cum ar fi ficatul, rămân sterile până la cinci zile după moarte.

Pe măsură ce corpul uman se descompune, microbii proliferează în sânge, ficat, splină, inimă și creier într-o manieră dependentă de timp; prin urmare, abundențele relative ale microbilor vor varia în funcție de organul corpului respectiv și de intervalul postmortem (PMI) 5. Pentru a aborda lipsa de cunoștințe cu privire la thanatomicrobiomul intern, descriem aici rezultatele celui mai mare studiu realizat până acum asupra comunităților microbiene postmortem ale organelor interne. Am emis ipoteza că, pe măsură ce corpul uman se descompune, thanatomicrobiomul din cadrul organelor interne se schimbă în structura comunității microbiene pe măsură ce timpul progresează. Pentru a evalua această ipoteză, am prelevat 27 de cadavre cu diferite momente de deces (interval 3,5-240 ore), în mai multe cauze de deces, folosind tehnologii de secvențiere a ampliconului 16S rRNA pentru a clasifica taxonii microbieni asociați cu organele cadavrelor. Mai mult, am demonstrat o corelație semnificativă în semnăturile thanatomicrobiomului, care au corespuns PMI. Astfel, am produs un catalog microbian al thanatomicrobiomului, care poate stabili un instrument criminalistic util și poate furniza informații constructive celor care studiază rămășițele umane.

Rezultate

Pentru a investiga profilele thanatomicrobiomice generate de secvențierea ampliconului genei ARNr 16S, am selectat și analizat organele interne (creier, inimă, ficat și splină), cavitățile bucale și/sau sângele a 27 de cadavre umane din cazuri penale reale cu intervale postmortem între 3,5– Au fost colectate 240 de ore (Tabelul S1). În total, am secvențiat ADN microbian pentru 66 de exemplare din cele 27 de cadavre. Curbele de rarefacție au demonstrat că, atunci când numărul de citiri de secvențe a crescut, bogăția speciilor a crescut considerabil cu fiecare probă (Fig. S1). Diversitatea alfa demonstrată de curbele de rarefacție a arătat că țesuturile au fost suficient secvențiate pentru a observa toți taxonii. Majoritatea eșantioanelor au atins o asimptotă, indicând citiri adecvate pentru compararea specimenelor.

Unitățile taxonomice operaționale individuale (OTU) au fost examinate pentru semnificația statistică și au fost determinate abundențele relative ale celor mai predominante 20 de genuri din toate eșantioanele (Fig. 1). Rezultatele au arătat că genurile bacteriene au fost similare între diferite organe din cadrul fiecărui sex, dar au fost diferite între femele și bărbați. O excepție de la această tendință este cavitatea bucală, pentru care au fost observate genuri similare pentru ambele sexe, așa cum se arată în Fig. 1. Cu excluderea a trei exemplare de gură, probele rămase formează un grup distinct în harta termică. ADONIS UniFrac ponderat pe probele de gură a dus la o diferență foarte nesemnificativă între sexe (p = 0,923). Abundențele relative de microbi din probele de sânge au fost similare la fiecare specimen pe măsură ce timpul a progresat (Fig. 1). ANOVA, examinând diferențele în diversitatea Shannon, a elucidat diferențe semnificative între toate tipurile de organe (p Tabelul 1 Rezultatele ADONIS pe baza distanțelor UniFrac neponderate și ponderate.

succesiunea

Abundența relativă a celor 20 de genuri cele mai predominante în toate eșantioanele.

În Fig. 2, sunt prezentate siturile corpului cu valori semnificativ diferite de α-diversitate între femele și bărbați. Au existat diferențe semnificative între femei și bărbați (p Figura 2

Abundența relativă a celor mai predominante bacterii între probele de sex feminin și mascul.

A fost generată o hartă de căldură pentru a vizualiza abundențele relative ale celor mai predominante 30 de genuri bacteriene (Fig. 3). Eșantioanele și genurile bacteriene au fost sortate conform metricilor euclidiene și, respectiv, distanțelor UniFrac neponderate. Harta de căldură a arătat relații similare; cavitatea bucală conținea organisme similare (de ex., Streptococ, Viellonella și Prevotella), cu toate celelalte tipuri de organe care posedă o comunitate mai asemănătoare între ele decât cavitatea bucală.

Heatmap pentru a vizualiza abundențele relative ale celor mai predominante 30 de genuri bacteriene.

Genurile și probele bacteriene au fost sortate pe baza distanțelor euclidiene și, respectiv, UniFrac.

Măsurile diversității microbiene au fost selectate pentru diferențe folosind testarea ADONIS pe baza distanțelor UniFrac (Tabelul 2). Diferențe semnificative (p Tabelul 2 Rezultatele ANOVA, testarea diferențelor în bogăția Chao1 și diversitatea Shannon între grupuri.

Analiza coordonatelor principale (PCoA) pe baza distanțelor Unifrac neponderate și ponderate a fost determinată pentru toate probele (Fig. 4). PCoA bazat pe distanțe UniFrac neponderate a relevat că probele de cavitate bucală au format un grup distinct de celelalte tipuri de specimene (Fig. 4a). PCoA pentru probele feminine cu un PMI ridicat s-au adunat aproape de 0 pentru ambele axe, așa cum se arată în Fig. 4b. Așa cum se vede în distanțele UniFrac PCoA neponderate, același grup distinct de cavitate bucală a fost descris în PCoA ponderat (Fig. 4c). Pentru distanța UniFrac ponderată PCoA cu PMI ilustrată, probele cu un PMI ridicat au fost localizate toate într-o zonă în jur de (0,1, -0,1). Din nou, toate acestea au fost probe de sex feminin care au avut un PMI ridicat (Fig. 4d).

(A) Analiza coordonatelor principale (PCoA) a diversității beta pe baza distanțelor Unifrac neponderate. (b) PCoA bazat pe distanțe Unifrac neponderate, cu PMI ilustrat. (c) PCoA bazat pe distanțele ponderate Unifrac și (d) distanțele Unifrac ponderate cu PMI ilustrate.

O analiză a fost efectuată pentru a determina corelațiile dintre familiile, genurile sau speciile PMI utilizând analiza aleatorie a pădurilor (Fig. 5, Tabelul S2) 15,16,17,18. Rezultatele au identificat o listă de impozite candidate care s-au schimbat din abundență în timp în funcție de sexe și tipuri de eșantion (Tabelul S2). Aceste analize demonstrează o necunoscută Clostridium sp. (Fig. 5a), Clostridium novyi (Fig. 5b), Prevotella bivia (Fig. 5c) și Prevotella timonensis (Fig. 5d). Pentru ambele genuri, au existat diferite specii care au crescut din abundență la începutul descompunerii, care au fost diferite de genurile care au dominat la PMI mai lungi. Interesant este că mai multe genuri, cum ar fi Clostridium și Prevotella, poseda diverse specii care erau potențial predictive pentru diferite perioade de descompunere. De exemplu, C. novyi a fost relativ mai abundent la ultimul PMI; totuși o necunoscută Clostridium speciile au fost mai abundente mai devreme în descompunere.

Taxa identificată dintr-o analiză forestieră aleatorie a corelațiilor dintre PMI și OUT.

Fiecare organ este reprezentat de o culoare diferită: Roșu = Creier, Verde = Inimă, Albastru = Ficat, Negru = Sânge, Cyan = Gură, Roz = Splină. Axa X este PMI în ore, iar axa Y reprezintă procentul de citiri de secvență atribuite speciei respective din eșantion. Rezultatele sunt prezentate pentru (A) Clostridium novyi, (b) un necunoscut Clostridium, (c) Prevotella bivia și (d) Prevotella timonensis.

Identitățile celor mai abundente filuri au fost, de asemenea, determinate pentru a arăta abundențele semnificativ diferite dintre organe (Fig. 6). În mod surprinzător, Firmicutes (care include Clostridium) este listat în toate comparațiile, ceea ce înseamnă că este probabil un biomarker stabil în comunitățile thanatomicrobiomice derivate din diferite locații ale corpului. Eșantioane cu valori p Figura 6

Rezultatele comparațiilor pentru identificarea filelor cu abundențe semnificativ diferite între exemplarele de cadavru.

Discuţie

În prezentul studiu, descriem modul în care am compilat cel mai cuprinzător sondaj de secvențiere bazat pe amplicon până în prezent pentru evaluarea thanatomicrobiomului uman al cadavrelor reale din lucrări penale. În ciuda abundenței descompunerilor microbiene în cadavre, există puține detalii despre microorganismele specifice implicate în decăderea organelor interne umane. La omul sănătos, se consideră că majoritatea organelor interne sunt sterile sau în general lipsite de microorganisme datorită supravegherii constante a sistemului imunitar 14,19. După moarte, sistemul imunitar nu mai este funcțional, iar proliferarea microbiană este facilitată de mediul bogat în nutrienți al cadavrului 5,11,17,18,20 .

Descompunerea umană este atribuită în primul rând bacteriilor; cu toate acestea, o revizuire a literaturii științifice demonstrează lipsa unor cunoștințe empirice cuprinzătoare despre identitățile bacteriilor care proliferează în organele interne umane după moarte. De exemplu, Can și colab. 5 au efectuat o cercetare microbiană a thanatomicrobiomului asociat cu țesuturile organelor interne din unsprezece cadavre folosind metode de pirosecvențiere Roche 454 independente de cultură. Rezultatele studiului au arătat că anaerobii obligați, Clostridium, a fost găsit în cadavre de diferite momente de deces, în timp ce anaerobul facultativ, Lactobacillus, a fost mai abundentă la cadavre cu intervale mai scurte după moarte (adică 29,5 ore față de 240 ore) 5. Potrivit lui Hyde și colab. (2013 și 2015) analize exploratorii ale bacteriilor prezente în cavitatea bucală și a resturilor rectale ale cadavrelor care se descompun în condiții naturale, s-a demonstrat că, într-un loc de prelevare a cadavrelor, a existat o variație între debutul și punctele finale ale stadiului de balonare 21, 22 .

O constatare interesantă a acestui studiu este apariția unui Pseudomonas sp. detectate exclusiv la cadavre feminine versus a Rothia sp. găsit într-un cadavru masculin. Pseudomonas este un bacil aerob, gram negativ, care provoacă infecții oportuniste grave la om.

Mai multe caracteristici interesante au fost identificate în analiza pădurilor aleatorii (Fig. 5, Tabelul S2). În primul rând, pe măsură ce adâncimea nivelului taxonomic în analiză a crescut (trecând de la regn la specie), la fel a explicat și varianța raportată procentuală. Analizele la nivel de familie și gen au explicat aproximativ 21% din varianța modelelor care corelează PMI cu variabilele de interes și analize la nivel de specie explicate 65% (Tabelul S2). În al doilea rând, organul intern a fost clasat în mod constant ca unul dintre primii 14 factori cei mai importanți din modele, iar sexul a fost în top 38.

Crearea unui catalog al contribuabililor microbieni discreți care guvernează schimbările structurale și dinamice ale thanatomicrobiomului uman este esențială pentru a stabili cum se produce putrefacția umană. Alte eforturi de cercetare au adoptat abordări similare pentru a interoga microbiota decăderii folosind surogate umane, cum ar fi șoarecii și porcii 12,16,18 și au stabilit că abundența anumitor bacterii (de exemplu, Firmicutes) în anumite momente de timp în timpul decăderii este indicativă a timpul morții. De exemplu, în Metcalf și colab. (2014), un „ceas microbian” a fost demonstrat într-un model de șoarece, iar estimările PMI au coroborat PMI-urile efective în aproximativ trei zile 16. În mod similar, rezultatele studiului nostru au arătat Firmicutes ca un potențial biomarker în comunitățile thanatomicrobiomului.

Un domeniu deosebit de important de evaluat este faptul că acest studiu nu a identificat expunerea la temperatura ambiantă ca un factor semnificativ la diferențele în structura comunității. Ar putea exista o eroare în definirea acelor expuneri termice, deoarece corpurile au fost găsite în locații diferite la temperaturi diferite 23. Alternativ, corpul poate izola suficient organele interne de variațiile termice, astfel încât alți factori (de exemplu, sexul) pot exercita o influență mai mare asupra comunității.

Studiul actual prezintă potențialul unei noi abordări pentru a determina timpul morții, folosind expertiza în genetică criminalistică, secvențierea ADN și bioinformatică. Până în prezent, studiul nostru reprezintă cel mai mare catalog de diversitate microbiană a componentelor interne ale thanatomicrobiomului uman. Mai mult, acest studiu a dezvăluit noi informații cu privire la modul în care populațiile microbiene se schimbă în diferite specimene interne în funcție de momentul când un om moare, ceea ce în prezent nu este bine stabilit. Determinarea timpului într-o fereastră îngustă este de o importanță supremă în investigațiile penale și este în concordanță cu atribuirea medicolegală de a furniza cunoștințe obiective, bazate pe dovezi și instrumente pentru a face față provocărilor geneticii criminalistice. Aceste informații sunt, de asemenea, utile pentru patologi și alți cercetători care lucrează cu descompunerea rămășițelor umane și animale, deoarece oferă informații cu privire la identitatea, localizarea și cronologia colonizării microorganismelor, care este probabil să se întâmple după moarte. Direcțiile viitoare vor include studii pentru a explica apariția Rothia, un coco-bacil Gram-pozitiv care cauzează o varietate de infecții grave, care a fost descoperit într-un caz masculin care a murit din cauza unui supradozaj accidental de droguri.

Proiectul microbiom postmortem uman (HPMP)

Proiectul Human Postmortem Microbiome (HPMP) se străduiește să cultive date care reprezintă o resursă extinsă care catalogează abundența și varietatea microorganismelor implicate în descompunerea oamenilor (și/sau a surogatelor umane) 4. Rolul grupului de lucru este de a oferi un cadru pentru comunitățile microbiene interne (thanatomicrobiom) și externe (necrobiom și mormânt). Obiectivul principal al HPMP este de a îmbunătăți înțelegerea și aplicațiile practice relevante pentru rezolvarea întrebărilor referitoare la modul de deces și estimările intervalului postmortem. În plus, acest proiect va încuraja eforturile concertate de validare și standardizare a protocoalelor pentru a stabili un cadru de utilizare în investigațiile criminalistice.

Metode

Cazuri de cadavru și colectare de probe

Extracția ADN Thanatomicrobiomului, amplificarea PCR și analizele de date MiSeq

Datele secvenței au fost apoi analizate la Laboratorul de Cercetare și Testare folosind o conductă standard de analiză a diversității microbiene constând din două etape majore, stadiul de denoisare și detectare a himerei și etapa de analiză a diversității microbiene. În timpul etapei de denoising și de detectare a himerei, denoising-ul a fost efectuat folosind diverse tehnici pentru a elimina secvențe scurte, secvențe singleton și citiri zgomotoase. Apoi, s-a efectuat detectarea himerei pentru a elimina secvențele himerice. În cele din urmă, secvențele rămase au fost apoi corectate de la bază la bază pentru a elimina zgomotul din fiecare secvență. În etapa de analiză a diversității, fiecare eșantion a fost rulat printr-o conductă de analiză pentru a grupa citirile în OTU-uri care apoi au trecut prin clasificare taxonomică pentru a identifica nivelul speciei.

Analize de date biostatistice

informatii suplimentare

Cum să citiți acest articol: Iavan, G. T. și colab. Succesiunea Thanatomicrobiomului uman și timpul de la moarte. Știință. reprezentant. 6, 29598; doi: 10.1038/srep29598 (2016).