Abstract

fundal

Acidul arahidonic (ARA) este un acid gras esențial și un constituent major al biomembranelor. Este transformat în diferiți mediatori lipidici, cum ar fi prostaglandina E2 (PGE2), care este implicată în dezvoltarea artritei reumatoide (RA). Cu toate acestea, efectele ARA dietetice asupra RA nu sunt clare. Obiectivul nostru a fost clarificarea efectelor ARA dietetice asupra unui model experimental de artrită de șobolan.

Metode

Șobolanii Lew au fost hrăniți cu trei conținuturi de dietă ARA (0,07%, 0,15% sau 0,32% ARA în dietă (g/g)), o dietă cu acid docosahexaenoic (DHA) (0,32% DHA) sau o dietă de control. După 4 săptămâni, artrita a fost indusă prin injectarea adjuvantului complet al lui Freund în tamponul posterior. Am observat dezvoltarea artritei timp de încă 4 săptămâni și am evaluat severitatea artritei, conținutul de mediatori de acizi grași și lipide din labă și expresia genelor legate de formarea mediatorului de lipide și citokinele inflamatorii. De asemenea, a fost evaluat tratamentul cu indometacin.

Rezultate

Conținutul de ARA al fosfolipidelor din labă a fost semnificativ crescut cu ARA dietetică într-o manieră dependentă de doză. ARA dietetică, precum și DHA nu au afectat severitatea artritei (edem labe, scor artrită și eroziune osoasă). Conținutul de PGE2 din labă a fost crescut prin inducerea artritei, dar nu a fost modificat de ARA dietetică. ARA dietetică nu a afectat conținutul altor mediatori lipidici și expresia genică a ciclooxigenazei (COX) -1, COX-2, lipoxgenazelor și citokinelor inflamatorii. Indometacinul a suprimat severitatea artritei și conținutul de PGE2 la labă.

Concluzie

Aceste rezultate sugerează că ARA dietetică crește conținutul de ARA la nivelul labei, dar nu are niciun efect asupra severității artritei și asupra conținutului de PGE2 al labei la un model de artrită de șobolan.

Introducere

Acizii grași polinesaturați (PUFA), cum ar fi acidul arahidonic (ARA) și acidul docosahexaenoic (DHA), sunt nutrienți naturali prezenți în produsele alimentare obișnuite (de exemplu, gălbenușul de ou, carnea și uleiul de pește) și sunt constituenți importanți fiziologic ai biomembranelor. ARA este un acid gras n-6 și este convertit din acid linoleic (LA) in vivo. ARA acționează, de asemenea, ca substrat pentru diferiți mediatori lipidici, cum ar fi prostaglandinele (PG), leucotrienele, lipoxinele (LX), endocanabinoizii și epoxieicosatetranoații [1-3]. Studiile recente au demonstrat că capacitatea de conversie de la LA la ARA a scăzut odată cu îmbătrânirea [4] și că suplimentarea dietetică cu ARA a îmbunătățit răspunsul cognitiv [5, 6] și funcția cardiovasculară [7, 8] la șobolanii vârstnici și vârstnici.

S-a clarificat că ARA dietetică afectează conținutul de ARA al fosfolipidelor la oameni și animale [9-14]. Un studiu ex vivo utilizând celule preparate din animale în care a fost manipulat aportul de acizi grași din dietă a arătat că diferite diete au afectat producția de PG și leucotriene [15-18]. Am raportat că suplimentarea ARA la persoanele în vârstă japoneze sănătoase a crescut ARA plasmatică, dar nu a crescut mediatorii lipidici derivați de ARA sau parametrii clinici, inclusiv parametrii inflamatori precum proteina C reactivă, interleukina-6 (IL-6) și factorul de necroză tumorală α (TNF-α) [12]. Recent am studiat efectele ARA dietetice asupra inflamației acute și am raportat că ARA dietetică a crescut conținutul ARA și LXA4 din colon, dar nu a afectat severitatea inflamației sau conținutul de PGE2 într-un model de colită murină [14].

Poliartrita reumatoidă (RA) este una dintre bolile autoimune majore și este asociată cu inflamația cronică a articulațiilor și a oaselor. Medicamentele antireumatice biologice care modifică boala sunt frecvent recomandate pentru terapia RA, indicând faptul că citokinele inflamatorii sunt molecule importante în patologia RA [19-21]. Medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene (AINS) și inhibitorii ciclooxigenazei (COX) nu mai sunt medicamente de primă linie pentru RA, dar înainte de apariția terapiei biologice, acești agenți erau folosiți pe scară largă pentru RA, deoarece mediatori lipidici produși din ARA de către COX, precum PGE2, sunt implicate în dezvoltarea RA [22, 23]. Prin urmare, metabolismul ARA este încă important în tratamentul RA, dar efectele ARA dietetice asupra inflamației cronice, cum ar fi RA, nu sunt pe deplin înțelese.

În prezentul studiu, pentru a clarifica efectele ARA dietetice asupra inflamației cronice și a statusului PGE2, am evaluat efectele ARA la diferite doze asupra severității unui model de artrită indusă de adjuvant (AIA) la șobolani și am determinat conținutul ARA și mediatori de lipide derivate din ARA și expresia genelor legate de acești mediatori de lipide și citokine inflamatorii.

Materiale și metode

Animale, diete și design experimental

Experimentele au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor din Suntory Holdings Ltd. (Osaka, Japonia) și am urmat liniile directoare pentru îngrijirea și utilizarea animalelor Suntory Holdings Ltd. Șaptezeci de șobolani Lew de sex masculin de 4 săptămâni au fost obținuți de la Charles River Japonia (Yokohama, Japonia). Șobolanii erau găzduiți în condiții standard și aveau acces gratuit la apă și la dietă.

Inducerea și evaluarea AIA

acid

Procedura experimentală pentru modelul de artrită indusă de adjuvantul de șobolan în prezentul studiu.

Analiza acizilor grași

Lipidele din diete, labe și plasmă au fost extrase și purificate prin metoda lui Folch și colab. [26]. Lipidele din labă și plasmă au fost separate în fosfolipide (PL) și alte fracțiuni lipidice prin cromatografie în strat subțire folosind silicagel 60 (Merck, Darmstadt, Germania). Sistemul de solvent consta din hexan/dietil eter (7/3, v/v). Reziduurile de acizi grași din lipidele extrase sau fosfolipidele separate au fost analizate prin metoda Sakuradani și colab. [27]. Pe scurt, fiecare fracțiune lipidică a fost incubată cu un standard intern (acid pentadecanoic) în HCI metanolic la 50 ° C timp de 3 ore pentru a transmetila resturile de acid gras în esteri metilici ai acidului gras, care au fost extrase cu n-hexan și analizat prin cromatografie capilară gaz-lichid.

Analiza mediatorilor lipidici ai omogenatului tamponului

Reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (QRT-PCR)

analize statistice

Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD. Datele au fost analizate prin testul t cu două cozi nepereche sau analiza unică a varianței, urmată de comparații multiple Dunnett sau Steel. Analizele de corelație au fost efectuate folosind testul de corelație Spearman. P

Rezultate

Conținutul de acid gras al labei posterioare și al plasmei

Efectele ARA dietetice asupra simptomelor AIA

Scorul de eroziune osoasă pentru articulația labelor posterioare contralaterale de la șobolani cu artrită indusă de adjuvant. La sfârșitul experimentelor, articulațiile genunchiului și gleznei labei contralaterale au fost fixate cu 10% formalină tamponată neutră și scorul de raze X a fost definit așa cum este descris în Materiale și metode. Datele sunt mijloace ± SD (n = 10 per grup).

Mediator lipidic și expresie genică

Inducția artritei a crescut semnificativ conținutul de PGE2 al labei (grupul ADV +/CON, 15,0 ± 17,5 pg/mg greutate umedă a țesutului; și grupul ADV-/CON; 1,8 ± 2,5 pg/mg greutate umedă a țesutului) (Figura 6a) . Conținutul PGE2 al labelor din grupurile hrănite cu ARA sau DHA nu a fost diferit de cel din grupul ADV +/CON. Tratamentul cu indometacină a suprimat semnificativ conținutul de PGE2 al labei. Conținutul de LXA4 (grupul ADV +/CON; 0,13 ± 0,1 pg/mg greutate umedă de țesut; și grupul ADV-/CON, 0,05 ± 0,1 pg/mg greutate umed de țesut) și LTB4 (grupul ADV +/CON; 0,81 ± 0,46 pg/mg greutate umedă în țesut; iar grupul ADV-/CON, 0,24 ± 0,16 pg/mg greutate umed în țesut) părea să crească odată cu inducerea artritei, dar nu semnificativ (Figura 6b și c). Nu s-au observat efecte ale dietelor sau indometacinei în conținutul LXA4 și LTB4. Pentru a elucida relația dintre conținutul ARA și conținutul PGE2 în volumul labei și labei, am analizat corelația acestor parametri în grupurile tratate cu adjuvant și ARA (grupurile 2-5). Așa cum se arată în Figura 7, nu am detectat nicio corelație între volumul ipsiralateral al picioarelor sau conținutul PGE2 al picioarelor cu conținutul ARA din picioare (Figura 7a și b), conținutul PGE2 al picioarelor cu volumul ipsiralateral al picioarelor (Figura 7c).

Analiza corelației. Au fost efectuate analize de corelație între conținutul ARA al labei posterioare ipsilaterale versus edemul labei (marker de boală) (A), Conținut PGE2 (b), și între edem labe versus conținut PGE2 (c). ●; ADV +/CON, △; ADV +/ARA (L), ◇; ADV +/ARA (M), (; ADV +/ARA (H).

Am analizat expresia genelor legate de formarea mediatorului lipidic, cum ar fi cPLA2, COX-1, COX-2, 5-LOX și 12/15-LOX (Fișier suplimentar 5: Figura S4 a-e). Doar expresia COX-1 din grupul ADV-/CON a fost semnificativ mai mică decât cea din grupul ADV +/CON, dar nici o altă expresie genetică nu a diferit între grupurile ADV- și ADV +/CON. Dieta ARA sau DHA nu a avut niciun efect asupra acestor expresii genetice. Tratamentul cu indometacină a crescut doar expresia genei ALOX5. În plus, pentru a determina efectele dietelor asupra producției de citokine legate de inflamație, am analizat, de asemenea, expresia genică a IL-1beta, IL-6, TNF-α și IL-10. Nu au existat diferențe între aceste grupuri în aceste gene (fișier suplimentar 6: Figura S5 a-d).

Discuţie

În studiul de față, suplimentarea ARA dietetică a crescut semnificativ conținutul de ARA în laba inflamată într-o manieră dependentă de doză, dar nu a afectat severitatea și conținutul mediatorilor lipidici într-un model de șobolan AIA. Acesta este primul studiu care demonstrează efectul ARA dietetic asupra AIA la șobolani.

Un alt mediator lipidic derivat din ARA, LXA4, este produs de 15 și 5-lipoxigenaze și este clarificat că are un rol antiinflamator [37]. În modelul de artrită animală, șoarecii cu deficit de 12/15-lipoxigenază au prezentat efecte inflamatorii sporite și niveluri scăzute de LXA4 [38], iar un agonist al receptorilor de lipoxină ar putea modula răspunsul imun și ar reduce severitatea artritei murine [39]. În prezentul studiu, conținutul de LXA4 în grupurile ARA a fost ușor mai mare comparativ cu grupul martor, dar nu s-au găsit diferențe semnificative sau dependență de doză (Figura 6), deși ARA dietetică a crescut conținutul de LXA4 în colon în studiul nostru anterior folosind un model de colită murină [14]. Aceste rezultate sugerează că efectele ARA dietetice asupra producției de LXA4 diferă în funcție de modelul de inflamație. LTB4, unul dintre leucotrienele majore, s-a dovedit a fi produs în articulațiile pacienților cu RA [40, 41]. În studiul de față, conținutul de LTB4 din labă a avut tendința de a fi crescut prin inducerea artritei și nu a fost afectat de ARA dietetică. Aceste rezultate sunt similare cu cele pentru modelul colitei [14] și sugerează că ARA dietetică are un efect redus asupra producției de LTB4.

Expresia genică a COX-1 și COX-2 este legată de sinteza PGE2, cea a 15-LOX și 5-LOX este legată de sinteza LXA4 și LTB4, iar cea a cPLA2 este legată de toți acești mediatori prin eliberarea ARA din membrană fosfolipide. Expresia genică a acestor mediatori a fost neschimbată prin ARA dietetică (Fișa suplimentară 5: Figura S4). Acest lucru este în concordanță cu rezultatele care arată că conținutul PGE2, LXA4 și LTB4 a fost neschimbat prin ARA dietetic (Figura 6). Cu toate acestea, deoarece nu am putut observa creșteri ale expresiei genelor prin inducerea artritei, cu excepția COX-1, nu putem trage o concluzie fermă cu privire la efectele sale asupra expresiei genice. Sunt necesare studii suplimentare, de exemplu un experiment de timp [42, 43], pentru a determina efectele ARA dietetice asupra expresiei genice legate de mediatorii lipidici. Aceste rezultate sunt similare cu cazul expresiei genice a citokinelor inflamatorii. În studiul de față, ARA dietetică nu a afectat expresiile genice ale acestor citokine in vivo (fișier suplimentar 6: Figura S5). Cu toate acestea, nu am putut observa creșteri ale expresiei genelor prin inducerea artritei și au fost necesare studii suplimentare pentru a determina efectul ARA dietetic asupra expresiei genice a citokinelor inflamatorii.

În acest studiu, am arătat cantitățile de mediatori lipidici în labe, dar contribuția lor la starea bolii nu este confirmată pe deplin. Deși PGE2, LXA4 și LTB4 sunt cunoscute a fi importante așa cum s-a descris mai sus, rămâne neclar dacă conținutul lor din prezentul experiment este suficient pentru a arăta sau nu activități fiziologice/patologice. Poate fi dezvăluit prin injectarea locală de PGE2, LXA4 și LTB4 sau, de exemplu, antagoniștii specifici. Cantitatea de peroxizi lipidici, generarea de radicali liberi și conținutul de antioxidanți din țesuturi și celule ar putea ajuta la clarificare. Mai mult, a fost bine cunoscut faptul că mediatorii lipidici pot afecta cantitatea de TGF-β beta [44]. Profilul citokinelor este, de asemenea, de așteptat să fie clarificat prin studii ulterioare.

S-a raportat că DHA, EPA sau uleiul de pește sunt eficiente împotriva artritei atât în ​​studiile pe animale, cât și în studiile clinice [31-34, 45], în timp ce unele studii nu au reușit să arate niciun beneficiu [32, 46]. În studiul de față, administrarea DHA a crescut semnificativ conținutul de DHA și EPA în labă, dar nu a afectat nici parametrii inflamatori, nici cantitățile de PGE2, LXA4 și LTB4. Unul dintre motive poate fi faptul că dietele experimentale din prezentul studiu au fost concepute pentru a avea un raport n-6/n-3 similar și, prin urmare, raportul n-6/n-3 a fost aproape același la control (2.0 ) și dieta DHA (2.2). Raporturile n-6/n-3 din studiile anterioare par diferite între grupurile martor și DHA, EPA sau ulei de pește sau neclare [31-34] și ar putea provoca diferența de eficacitate DHA.

Din câte știm, există un studiu în 1997 cu privire la efectele ARA asupra AIA la șobolanii cu deficit de acizi grași esențiali (EFAD). Suplimentarea cu ARA ar putea crește conținutul de ARA în EFAD și ar putea recupera răspunsul inflamator suprimat la șobolanii EFAD în comparație cu șobolanii normali [47]. Acesta a fost un raport timpuriu și important, dar nu reflectă neapărat situația artritei generale. Profilul de acizi grași din EFAD este destul de anormal, adică ARA și LA sunt extrem de reduse. Mai mult, acidul Mead, care a fost clarificat pentru a avea proprietăți antiinflamatorii [48-50], a fost sintetizat endogen în loc de ARA în EFAD și a fost redus prin administrarea ARA [47]. De asemenea, se raportează că acidul Mead este detectat în cartilajul articular al nou-născuților, sugerând că acidul Mead ar putea avea roluri necunoscute în dezvoltarea cartilajului [51]. Prin urmare, este dificil de estimat efectele ARA asupra AIA din raportul anterior în condiția EFAD.

Aporturile dietetice ARA pentru grupurile ARA (L), ARA (M) și ARA (H) au fost estimate la aproximativ 35, 73 și, respectiv, 156 mg/kg/zi, pe ipoteza că șobolanii au consumat o dietă de aproximativ 10 % din greutatea corporală zilnică. La om, aportul mediu de ARA din alimentele zilnice este de aproximativ 150-200 mg ARA pe zi [52]. În comparație cu aportul ARA la om, dozele ARA utilizate în prezentul studiu sunt semnificativ mai mari. Rezultatele din prezentul studiu pot fi astfel considerate ca fiind cele sub administrare ARA în exces.

Concluzie

Suplimentarea ARA dietetică a crescut semnificativ conținutul de ARA în laba inflamată într-o manieră dependentă de doză, dar nu a afectat parametrii inflamatori ai artritei sau conținutul mediatorilor lipidici într-un model de șobolan AIA.