Abstract

  • antioxidanți
  • îmbătrânire
  • dietă
  • dopamina
  • GABA
  • norepinefrina
  • striatum
  • cerebel
  • comportament cognitiv

Deși s-au dedicat numeroase cercetări pentru delimitarea celor mai critici factori care pot explica această pierdere neuronală funcțională în timpul îmbătrânirii și pierderea îmbunătățită a bolilor neurodegenerative legate de vârstă [Alzheimer (AD) și Parkinson (PD) boli specificațiile au fost evazive. Cu toate acestea, studii recente au sugerat că una dintre cele mai importante ar putea fi scăderile legate de vârstă în capacitatea de a atenua efectele pe termen lung ale stresului oxidativ (OS). De exemplu, SO poate fi un factor etiologic primar atât în ​​AD (Finch și Cohen, 1997), cât și în PD (Jenner, 1996) și există o creștere a vulnerabilității OS în funcție de vârstă (Joseph și colab., 1996). Dovezile indică, de asemenea, că există reduceri ale antioxidanților endogeni în timpul îmbătrânirii (de exemplu, glutation, Ohkuwa și colab., 1997; și glutamină sintetază, Carney și colab., 1994), cu creșteri ale peroxidării lipidelor (Migheli și colab., 1994; Yu ., 1994).

lung

Având în vedere aceste considerații, am considerat că ar putea fi posibil să se contracareze dietetic scăderile protecției antioxidante care apar în timpul îmbătrânirii prin creșterea aportului de fructe și legume identificate ca fiind bogate în activitate antioxidantă (Yamori și Horie, 1994; Cao și colab., 1995, 1996; Meydani și colab., 1995; Taylor și Nowell, 1997; Wang și colab., 1996). S-a constatat deja că un astfel de consum reduce incidența cancerului (Doll, 1990; Willett, 1994a, b) și a bolilor de inimă ischemice (Hughes, 1995; Mayne, 1996).

În creier, consumul de glicozide flavonoide ale ginkgo biloba a scăzut afectarea memoriei (Rai și colab., 1991), dificultăți de concentrare (Kleijnen și Knipshild, 1992a, b), creșteri ale Ca +2 ale metabolismului oxidativ neuronal (Oyama și colab., 1993, 1994) și progresia AD (Kanowski și colab., 1996). Astfel, cercetările actuale s-au îndreptat spre determinarea dacă apariția timpurie a scăderilor sensibilității receptorilor (la vârsta de 15 luni la șobolanii Fischer 344), pierderea homeostaziei calciului (Landfield și Eldridge, 1994) și performanța cognitivă ar putea fi prevenită cu 8 luni (6-15 luni) de hrănire a unei diete de control sau a unor diete care conțin vitamina E sau extracte de căpșuni sau spanac. Căpșunile și spanacul au fost identificate anterior (Cao și colab., 1995, 1996; Wang și colab., 1996) prin testul capacității de absorbție a radicalilor de oxigen (ORAC) ca fiind bogat în activitate antioxidantă.

MATERIALE ȘI METODE

Animale

Subiecții au constat din 80 de șobolani Fischer 344 masculi (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN). Șobolanii au fost adăpostiți individual în cuști suspendate din plasă din oțel inoxidabil, au furnizat hrană și apă ad libitum și au fost menținuți pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Toate animalele au fost observate zilnic pentru semne clinice de boală.

După o perioadă de aclimatizare de 12 zile la instalație, șobolanii în vârstă de 6 luni au fost asortați greutății, au primit 2 săptămâni în dieta de control (AIN-93 modificat) (Tabelul 1) și au fost repartizați aleatoriu în unul din cele patru grupuri dietă sau dieta de control suplimentată cu 500 UI acetat de vitamina E, 0,95% (greutate/volum) extract de căpșuni sau 0,64% extract de spanac (Tabelul 1). Au fost hrăniți cu aceste diete timp de 8 luni înainte de testarea experimentală. Cantitățile de extracte de căpșuni sau spanac adăugate în dietele de control s-au bazat pe o activitate ORAC echivalentă, astfel încât fiecare dietă să ofere activitate antioxidantă echivalentă (1,36 mmol echivalent Trolox pe kilogram de dietă). Au fost înregistrate greutățile lunare și aporturile alimentare (pe o perioadă de 48 de ore). Aceste animale au fost utilizate în conformitate cu toate legile și reglementările aplicabile, precum și cu principiile exprimate în National Institutes of Health, United States Public Health Service Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor din centrul nostru.

Dietele hrănite la șobolani (timp de 8 luni, de la vârsta de 6-15 luni)

Pregătirea dietei

Am adăugat 400 g de probă în apă în raport de 2: 1 pentru căpșuni și spanac, apoi l-am omogenizat într-un blender timp de 2 minute. Omogenatul recuperat a fost centrifugat la 13.000 × g timp de 15 minute la 4 ° C. Supernatantul a fost apoi recuperat și combinat în pungi pentru congelator, 500 ml/pungă. Extractul a fost congelat și apoi zdrobit și plasat în uscătorul de congelare până la uscare, ceea ce necesită de obicei aproximativ 7 d. Extractele liofilizate au fost expediate către Research Diets Inc. (New Brunswick, NJ) unde au fost combinate cu o dietă de control (Tabelul 1). Cantitatea de amidon de porumb din dieta martor a fost ajustată corespunzător atunci când s-au adăugat acetat de vitamina E și extracte de căpșuni sau spanac.

Proceduri

Eliberarea dopaminei. Eliberarea dopaminei (DA) a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Joseph și colab., 1988a, b; 1990). Pe scurt, au fost obținute felii striatale tăiate încrucișate (300 μm, tocator de țesut McIlwain) de la animalele menținute în diferitele diete. Feliile au fost plasate în flacoane mici de sticlă conținând soluția Krebs modificată - soluție Ringer mediu de eliberare bazală (BRM) care a fost barbotată timp de 30 de minute cu 95% O2 și 5% CO2 și care conținea (în mm) NaHCO3 21, glucoză 3.4 NaH2PO41.3, EGTA 1, MgCl2 0,93, NaCl 127 și KCl 2,5 (KCl scăzut), pH 7,4. Au fost apoi plasate în camerele de perfuzie în care au fost menținute la 37 ° C și perfuzate cu BRM timp de 30 de minute. După această perioadă de echilibrare, mediul a fost apoi schimbat la unul care conține (în mm) KCl 30, CaCl2 · 2 H2O 1,26 (în locul EGTA) și NaCl 57 și 0 sau 500 μm oxotremorină și îmbunătățirea K + - a fost evaluată eliberarea evocată de dopamină striatală (K + -ERDA). Eliberarea DA a fost apoi cuantificată prin HPLC cuplată la detectarea electrochimică. Datele au fost exprimate ca picomoli pe miligram de proteine, determinate prin procedura Lowry (Lowry și colab., 1951).

Electrofiziologie. Șobolanii din diferitele grupuri de dietă au fost anesteziați cu uretan (0,75-1,25 gm/kg), intubați și li s-a permis să respire spontan. Reflexul cornean și vârful degetelor de la picioare au fost utilizate pentru a monitoriza nivelul anestezic pentru a stabili planuri egale de anestezie. Un tampon de încălzire a fost utilizat pentru a menține temperatura corpului la 37 ° C. Animalele au fost plasate într-un cadru stereotaxic, iar pielea și mușchiul peste vermisul posterior au fost îndepărtate. Cisterna a fost drenată, iar craniul și dura peste vermis au fost îndepărtate. O soluție de 2% agar în soluție salină a acoperit creierul. Înregistrările au fost făcute în lobulele VI și VII ale vermisului cerebelos din celulele Purkinje, identificate prin locația anatomică și caracteristica complexă a celulelor Purkinje.

Semnalele neuronale au fost amplificate și filtrate (-3 dB la 0,3 și 5 kHz) și afișate pe un osciloscop de stocare. Potențialele de acțiune au fost izolate utilizând un discriminator de fereastră, iar ieșirea a fost afișată folosind un înregistrator de diagrame. Unitățile unice trebuiau să aibă un raport semnal-zgomot de cel puțin 2: 1. Micropipetele de sticlă multibarrel au fost utilizate pentru înregistrarea cu o singură celulă și pentru aplicarea locală a medicamentului prin microiontoforeză (rezistența electrozilor de înregistrare 1,5-3,3 Ω). În micropipetele din sticlă multi-barilă, două butoaie au fost umplute cu NaCl 3 m, iar celelalte două butoaie au fost umplute cu GABA (0,25 m, pH 4,0-4,5) și cu agonistul β-adrenergic, izoproterenol (ISO) (0,25 m, pH 4.0–4.5), respectiv. O sursă de curent constant a furnizat curenți de ejectare și de reținere pentru butoaiele de droguri și a trecut un curent egal de polaritate opusă prin butoiul de echilibru pentru a neutraliza potențialul vârfului. Pulse uniforme de medicament au fost aplicate la intervale regulate.

GABA a fost aplicat local prin microiontoforeză pentru a produce o inhibare de 10-30% a ratei de tragere spontană. Isoproterenolul a fost apoi aplicat concomitent până când s-a observat fie o modificare a răspunsului la GABA, fie o modificare a ratei spontane de bază. Patru aplicații ale GABA au fost date înainte ca ISO să fie co-administrat.

După ce ISO a fost oprit, GABA a fost dat până când s-a putut determina dacă nivelul pre-ISO al inhibiției GABAergic ar reveni. Au fost analizate numai celulele în care nivelul post-ISO al inhibiției GABAergic s-a potrivit cu nivelul pre-ISO al inhibiției GABAergic. Răspunsurile induse de droguri au fost cuantificate prin computer. Datele contorului de viteză au fost digitalizate și s-au calculat procentul de inhibiții ale ratei de tragere rezultate din aplicațiile de droguri.

Pentru aceste experimente, labirintul a constat dintr-un bazin circular din fibră de sticlă neagră (134 cm diametru × 50 cm înălțime), umplut la o adâncime de 30 cm cu apă menținută la 23 ° C. Bazinul a fost împărțit în patru cadrane de dimensiuni egale. Platforma circulară de evacuare (10 cm în diametru) era colorată în negru și, prin urmare, ascunsă vederii. Platforma a fost scufundată la 2 cm sub suprafața apei în centrul unuia dintre cadrane; locația sa a fost schimbată într-un cadran diferit pentru fiecare sesiune de testare. Labirintul a fost plasat într-o cameră cu luminile estompate și pe pereți erau numeroase repere extramaze.

Testarea MWM a fost efectuată zilnic timp de 4 zile consecutive, cu o sesiune de dimineață și o după-amiază, două probe fiecare sesiune, cu un interval intertrial de 10 minute între cele două studii. La începutul fiecărui studiu, șobolanul a fost scufundat ușor în apă într-una din cele patru locații de start randomizate (situate la 90 ° distanță pe perimetrul bazinului). Fiecărui șobolan i s-a permis să scape 120 de secunde pe platformă; dacă războiul nu a reușit să scape în acest timp, a fost ghidat spre platformă. Odată ce șobolanul a ajuns pe platformă, a rămas acolo timp de 15 secunde (procesul 1, memoria de referință sau procesul de achiziție). Șobolanul a fost readus în cușca sa de acasă între probe (10 minute). Procesul 2 (memoria de lucru sau procesul de recuperare) a folosit aceeași locație a platformei și poziția de pornire ca și testul 1. Performanța (latența de a găsi platforma în secunde, distanța a înotat în centimetri și viteza de înot în centimetri pe secundă) pe fiecare proces a fost înregistrată video și analizat cu software de urmărire a imaginilor (HVS Image, Hampton, Anglia).

REZULTATE

Greutăți și aporturi alimentare

Șobolanii s-au îngrășat de la 6 la 15 luni = F (11,36) = 215,44; p 0,05) sau la vârsta de 15 luni (p> 0,05). De asemenea, nu au existat diferențe în ceea ce privește consumul de alimente între grupurile de dietă pe parcursul studiului (p> 0,05).