Termeni asociați:

  • Clorură de tionil
  • Agent antihelmintic
  • Levamisol
  • Larvă
  • Agar
  • Agaroză
  • Amină
  • Epoxid
  • Anhidridă acetică
  • Chitinaza

Descărcați în format PDF

subiectelor

Despre această pagină

Abordări pentru proiectarea și sinteza medicamentelor antiparazitare

Satyavan Sharma, Nitya Anand, în Biblioteca de Farmacochimie, 1997

4.2.1 Tetramisol

S-a constatat că tetramisolul este extrem de eficient împotriva Ascaris lumbricoides la om. La o doză orală unică de 3-8 mg/kg, sa demonstrat că medicamentul produce rate de vindecare de 79-100%, cu o reducere ridicată a numărului de ouă fecale. Doza recomandată de tetramisol pentru ascariază este de 50-80 mg/copil și 100-150 mg/adult [1,50,51]. Tetramisolul produce, de asemenea, cure de până la 75% împotriva infecțiilor cu hookworm la om, la o doză de 2,5-5 mg/kg administrată zilnic timp de 3 zile [50-52] .

Caenorhabditis elegans: Biologie celulară și fiziologie

Lois G. Edgar, Bob Goldstein, în Methods in Cell Biology, 2012

C Note

Adăugarea de tetramisol (Sigma T1512, o soluție stoc de 10 mg/mL în H2O diluată la aproximativ 100 μg/mL în săruri de ouă) este opțională; acest medicament paralizează viermii și ușurează tăierea. Tăiați imediat: dacă sunt prea contractați, viermii nu ar elibera multe ouă. Utilizați o lamă de bisturiu proaspătă în fiecare zi, deoarece acestea se corodează rapid. Excesul de tetramisol va duce la formarea unui precipitat în soluția de NaOCl.

Pentru randament maxim, mai multe ouă pot fi eliberate prin tratarea viermilor tăiați timp de aproximativ 1 min cu un volum egal de soluție de NaOCl adăugat direct la picătura de tăiere. De îndată ce ouăle sunt eliberate, adăugați același volum de EGM ca NaOCl folosit pentru a preveni deteriorarea ulterioară a ouălor. Acest tratament va ucide etapele pronucleare și va deteriora embrionii cu o singură celulă. Tratamentul cu NaOCl de 3 minute este încă necesar înainte de tratarea cu chitinază pentru o digestie uniformă. Pentru ouă mai devreme de etapa cu două celule, în care coaja este încă oarecum permeabilă, adăugați un volum egal de EGM imediat ce viermii sunt tăiați. După aceasta, mulți pot supraviețui tratamentului NaOCl și chitinazei de 3 minute, iar unii vor fi încă în stadiul cu o singură celulă după tratamentul chitinazei și îndepărtarea plicului de vitelină dacă lucrați rapid.

Dacă digestia chitinazei nu funcționează în decurs de 8 minute, probabil că nu va funcționa deloc. Cele mai frecvente probleme sunt hipocloritul sau starea fiziologică a viermilor (depunerea în prima zi pare să dea ouă mai dure). Hipocloritul ar trebui să fie un lot neexpirat și, de obicei, devine slab cu o lună sau cam așa înainte de data expirării. Păstrați stocul la frigider într-o sticlă cu aerisire întunecată, umplută până aproape de vârf. Amestecați un tub de 3 ml chiar înainte de a începe și păstrați-l pe gheață; va funcționa aproximativ 3 ore și ar trebui apoi înlocuit.

După tratamentul enzimatic și mai ales după permeabilizare, embrionii sunt destul de lipicioși și se vor aglomera; acest lucru poate fi redus la minimum prin pipetarea uneia sau doar câteva la un moment dat. Mormanele mici pot fi rupte prin expulzarea din pipetă cu puțină forță de câteva ori.

Pipetele de permeabilizare sunt trase cu mâna în același mod ca și pipetele de transfer, folosind capilare de injecție Kwik-fil (1B100F-4 de la World Precision Instruments). Firul interior poate ajuta la tăierea plicului de vitelină. Tragerea ideală oferă o conicitate graduală lungă în secțiunea subțire, astfel încât să poată fi tăiată la diametrul dorit. Pipetele sunt tăiate cu o lamă de bisturiu proaspătă pe Parafilm sub scopul disecării. Un adaptor pentru pipeta bucală poate fi realizat cu tuburi Tygon cu alezaj mic filetat pe un ac de seringă atașat la un tub bucal. Umpleți vârful pipetei cu EGM înapoi la orificiul mai larg și testați pe primul lot de embrioni chitinați; tăiați vârful pipetei dacă este prea mic. Dimensiunea ideală va varia în funcție de vârsta embrionului pe care încercați să îl obțineți; etapele foarte timpurii sunt mai fragile și au nevoie de o gaură puțin mai mare; embrionii mai mari de opt celule se comprimă cu mai puține daune și vor ieși adesea din pipetele mai mari cu plicul vitelin intact. Astfel de embrioni nepermeabilizați vor continua să se dezvolte până la stadiul de eclozare.

Utilizați o seringă pe pipeta pentru gură pentru umplerea și curățarea pipetelor de permeabilizare; permeabilizarea efectivă se face prin presiunea aerului din gură. Pipetele pot sta în aer câteva ore fără să se usuce, deoarece orificiul este atât de mic, dar pe măsură ce se usucă, acestea se vor înfunda. Păstrați pipetele (una bună merită păstrată și va dura câteva săptămâni) prin spălarea vârfului de mai multe ori cu apă distilată și suspendarea vârfului pipetei într-un tub de apă distilată sterilă sau HCI 0,1 M, folosind o bandă „steag” pe pipetați astfel încât să nu se scufunde complet.

Dacă pipeta are dreptate, durează doar câteva minute pentru a permeabiliza un lot de embrioni aspirându-i individual în pipetă și expulzându-i ușor. Ele vor ieși mai mult sau vor fi mai puțin comprimate în funcție de diametrul interior al pipetei, dar se rotunjesc din nou în câteva minute. Dacă există o mulțime de liză cu permeabilizare, fie digestia a fost incompletă, fie orificiul pipetei a fost prea mic. Deoarece membranele celulare sunt destul de labile timp de 4-5 minute după începerea citokinezei, embrionii devitelinizați în timpul și imediat după clivaj se pot liza sau blastomerii se pot contopi, supunându-se ulterior unui clivaj tetrapolar anormal. Dacă este critic, verificați în timpul experimentului și eliminați acești embrioni.

O genă foarte fină (un instrument tradițional de microscopie electronică) montată pe o scobitoare cu adeziv este instrumentul cel mai satisfăcător pentru separarea manuală rapidă a blastomerului; funcționează și un ac de sticlă, dar se rupe ușor. Genele pot fi curățate cu alcool și un șervețel. Blastomerii se lizează dacă sunt separați imediat după o diviziune; 5-10 minute după decolteu este cel mai bun moment pentru manipulări reușite, cu excepția cazului în care aveți nevoie de separări anterioare. Separările AB/P1 sunt cele mai ușoare. Embrionii cu patru celule pot fi, de asemenea, separați. Alternativ, pentru a obține blastomere P2 și EMS, P1 poate fi separat după prima divizie și EMS/P2 după a doua. Blastomerii din linia P pot fi recunoscuți după mărimea relativă și dispunerea lor liniară. Cu randament scăzut, MS, E, P3 și C pot fi separați de cei patru descendenți ai unui blastomer izolat inițial P1. Identificările celulare făcute pe baza mărimii celulelor pot fi confirmate examinând perioade distincte ale ciclului celular.