Abstract

Tilacoidele din plante verzi cresc sățimea prin afectarea hormonilor apetitului, cum ar fi grelina, colecistokinina (CCK) și peptida-1 asemănătoare glucagonului (GLP-1). Obiectivul acestui studiu a fost de a investiga dacă tilacoidele afectează, de asemenea, pasajul gastrointestinal (GI) și compoziția microbiană. Pentru a analiza efectele asupra trecerii GI, 16 șobolani au fost hrăniți cu gavaj o dietă bogată în grăsimi (HFD) de control sau suplimentată cu tilacoid cu 30 de minute înainte de a primi albastru Evans. Alți 16 șobolani au fost hrăniți cu HFD martor sau HFD tilacoid timp de două săptămâni înainte de provocarea intragastrică cu Evans blue. Cantitatea de albastru Evans din stomac și distanța de migrație în intestine după 30 de minute au fost utilizate ca măsurare a golirii gastrice și a tranzitului intestinal. Acestea au fost reduse prin suplimentarea cu tilacoid în studiul acut și totuși nu în mod semnificativ, de asemenea, după studiul de dietă de două săptămâni.

Al doilea obiectiv al studiului a fost de a investiga dacă suplimentarea cu tilacoid afectează microbiota intestinală și cantitatea de grăsime fecală la voluntarii umani sănătoși (n = 34) primind tratamente cu tilacoid sau placebo timp de trei luni. Microbiota a fost analizată utilizând secvențierea genei 16S rARN și qPCR, iar grăsimea fecală a fost extrasă cu diclormetan. Numărul total de bacterii și, în special, Bacteriodes fragilis grup, au fost crescute prin tratamentul cu tilacoid versus placebo, în timp ce tilacoidele nu au cauzat steatoree. Suplimentarea alimentară cu tilacoizi afectează astfel sațietatea atât prin intermediul hormonilor apetitului, cât și prin plinătatea GI și afectează compoziția microbiană fără a provoca efecte adverse GI, cum ar fi steatoreea. Acest lucru sugerează tilacoidele ca un agent nou în prevenirea și tratamentul obezității.

fundal

Tilakoidele fac parte din cloroplastul din toate frunzele verzi, deoarece sunt locurile pentru fotosinteză. Tilakoidele constau din diverse proteine ​​legate de membrană, galactolipide, fosfolipide și antioxidanți precum clorofila, carotenoidele, zeaxantina și luteina [6]. S-a constatat anterior că tilacoidele extrase din spanac prelungesc lipoliza [7], scad absorbția glucozei peste peretele intestinal și creează un strat suplimentar temporar care acoperă partea mucoasă a intestinului [8]. În studiile la animale, suplimentarea cu tilacoid are ca rezultat o cantitate scăzută de grăsime corporală [9] și o scădere a aportului de alimente [10, 11]. În studiile de intervenție la om, s-a demonstrat că tilacoidele promovează sațietatea afectând plinătatea subiectivă, foamea și nevoia de alimente specifice, precum și îmbunătățesc eliberarea hormonului supresor al apetitului colecistokinină (CCK), peptida-1 asemănătoare glucagonului (GLP) -1) și leptină și pentru a suprima hormonul foamei grelină [12-16]. De asemenea, au fost raportate efecte asupra homeostaziei glucozei și insulinei după mesele standardizate, precum și în starea de repaus alimentar [12, 13, 15]. Mai mult, suplimentarea cu tilacoid favorizează pierderea în greutate corporală la om; 6,3% în trei luni [12].

Scopul prezentului studiu a fost de a investiga modul în care suplimentarea cu tilacoid afectează golirea gastrică, tranzitul intestinal și concentrațiile plasmatice ale CCK, utilizând două modele de șobolani; una care măsoară efectele imediate ale unei diete bogate în tilacoizi cu grăsimi prin gavaj și una care măsoară efectele după două săptămâni de supliment de tilacoid în dietă. Al doilea obiectiv a fost de a măsura modificările compoziției microbiene la fecale, precum și cantitatea de grăsime fecală, după suplimentarea zilnică cu tilacoid de trei luni la femeile supraponderale.

Metode

Experimente pe animale

Studiu acut; HFD prin gavaj

Consum alimentar ad libitum de două săptămâni

În studiul de tratament de două săptămâni, șobolanii au fost împărțiți în două grupuri; unul care primește acces ad libitum la HFD tilacoid (n = 8) și unul care primește acces ad libitum pentru a controla HFD (n = 8) timp de 2 săptămâni. În ultima zi, șobolanii au fost ușor anesteziați cu fluotan și o doză intragastrică în bolus de albastru Evans a fost administrată prin gavaj. 30 de minute mai târziu șobolanii au fost profund anesteziați și s-a efectuat aceeași procedură descrisă pentru studiul acut.

Analize de golire gastrică și tranzit intestinal

Probele intestinale și stomacale au fost centrifugate la 3000 × g timp de 30 de minute la 4 ° C, după care 1 ml din fiecare probă a fost transferat în tuburile Eppendorf și centrifugat la 16.000 × g timp de 60 de minute la 4 ° C. 100 μL din fiecare probă au fost încărcate în cele din urmă pe o placă cu 96 de godeuri și absorbanta a fost citită la o lungime de undă de 565 nm (A565). Procentele de golire gastrică și migrația Evans au fost calculate folosind ecuațiile 1 și 2 [19].

Ecuația 1. Procentul de golire gastrică a fost calculat prin formula:

Ecuația 2. Procentul migrației Evans a fost calculat prin formula:

Experiment uman

Probele fecale au fost colectate de la 34 de femei supraponderale (n = 18 în grupul tilacoid, n = 16 în grupul de control) care fuseseră înscriși într-un studiu de 12 săptămâni de dietă și tratament de intervenție descris anterior [12]. O băutură de afine, cu sau fără supliment de tilacoid, a fost ingerată în fiecare dimineață timp de 12 săptămâni. Băutura de afine conținea 50 ml supă de afine (Ekströms original, Procordia Food AB, Eslöv, Suedia) și 2,8 g ulei de rapiță (Zeta, Di Luca și Di Luca AB, Stockholm, Suedia). În băutura de afine tilacoidă s-au adăugat 5 g de Appetil (Greenleaf Medical, Stockholm, Suedia). Conținutul caloric a fost de 209 kJ/50 kcal în băutura tilacoidă și 188 kJ/45 kcal în băutura de control. Criteriile de excludere au fost diabetul, alergiile și intoleranța alimentară, sindromul intestinului iritabil, utilizarea recentă a antibioticelor (în termen de șase luni de la includere), precum și faptul că ați fost vegetariană, fumătoare, însărcinată sau ați urmat o dietă de slăbit în ultimele trei luni.

În timpul perioadei de intervenție de 12 săptămâni, subiecții au fost instruiți să consume trei mese pe zi și să nu aibă gustări între mese, precum și să efectueze 30 de minute de exerciții fizice intense în medie, în fiecare zi. În timpul intervenției de 12 săptămâni, toți subiecții au scăzut în greutatea corporală, iar grupul tilacoid a scăzut semnificativ mai mult în greutatea corporală și în nivelurile lipidelor din sânge. Mai multe detalii care descriu procesul uman, iar rezultatele pot fi găsite în studiul anterior [12].

În acest studiu, au fost incluse doar 34 din cele 36 de femei inițiale, din cauza neconformității cu predarea probelor fecale. Experimentul a fost realizat în conformitate cu liniile directoare stabilite în Declarația de la Helsinki și toate procedurile care implică subiecți umani au fost aprobate de Comitetul de Etică al Universității Lund (nr. 2006/361). Consimțământul informat scris și verbal a fost obținut de la toți participanții înainte de începerea experimentului.

Eșantioanele fecale au fost colectate de participanți în mediul lor de origine în termen de două zile înainte de a ajunge la clinică și introduse la -20 ° C direct după colectare. Participanții au primit tuburi sterile de 50 ml cu o lingură mică atașată în capac, special concepută pentru acest scop. La clinică, probele colectate au fost decongelate și împărțite în două; o parte a fost menținută la -80 ° C până când s-au făcut analize bacteriene și cealaltă parte a fost introdusă într-un recipient de sticlă deschis și lăsată să se usuce la 100 ° C timp de 48 de ore înainte de efectuarea analizei conținutului de grăsime.

Analiza conținutului de grăsime

Materialul fecal uscat (

Analiza microbiotei

Extracția ADN-ului

ADN-ul din probele fecale a fost izolat și purificat folosind kitul de țesuturi ADN EZ1 și mașina robot EZ1 Advanced XL (card Bacteria; Qiagen, Hilden, Germania) așa cum s-a descris anterior [19]. Pentru a perturba în continuare pereții celulelor bacteriene, a fost adăugată o etapă de batere a mărgelei timp de 45 de minute la 4 ° C înainte de extracție în EZ1 Advanced XL. ADN-ul extras a fost depozitat în 1-tampon TE la 4 ° C până la analize suplimentare.

PCR cantitativ în timp real

Tilacoizi

Tilacoidele (Appetil®) utilizate în studii au fost furnizate de Greenleaf Medical AB (Stockholm, Suedia). Extracția tilacoidelor, în acest caz din frunzele de spanac, a fost descrisă anterior [9], cu diferența că această pulbere a fost obținută după uscarea în tambur. Totuși, tilacoidele pot fi obținute din toate frunzele verzi. 100 g pulbere de tilacoid conțin 41,7 g carbohidrați (din care 38,7 g fibre insolubile), 23,5 g proteine ​​și 11,9 g grăsimi.

Analize biochimice

Concentrația plasmatică a CCK a fost măsurată numai în studiul acut la șobolan, în probele de sânge prelevate la 30 de minute după doza orogastrică în bolus de albastru Evans. CCK a fost măsurat folosind RIA cu un antiser seric specific (92128, limită de detecție 0,1 pmol/L) conform unei metode descrise anterior [20].

Analize statistice

Analizele statistice ale datelor s-au făcut folosind Prism, versiunea 6 (GraphPad software Inc., San Diego, CA, SUA). În ceea ce privește experimentele la șobolani, datele au fost controlate pentru normalitate utilizând testele de normalitate Shapiro-Wilk și KS și au trecut normalitatea pentru toate cazurile, cu excepția procentului acut de migrație Evans. Prin urmare, Mann Whitney t-testul a fost folosit în mod specific pentru acest calcul, în timp ce Studenții t-testul a fost utilizat pentru calculele rămase referitoare la experimentul cu șobolan. De asemenea, datele descriptive pentru subiecții umani și cantitatea de conținut de grăsime fecală au trecut de calculele de normalitate, iar diferențele statistice au fost evaluate cu studenți împerecheați t-test în cadrul fiecărui grup de tratament. Pentru microbiota, evaluările statistice au fost efectuate folosind măsurile repetate non-parametrice testul Wilcoxon. O valoare de P ≤ 0,05 a fost considerat semnificativ diferit.

Rezultate

Efectul tilacoidelor asupra golirii gastrice și a tranzitului intestinal

Șobolanii tratați cu tilacoizi, atât acut, cât și administrat ca supliment alimentar timp de două săptămâni, au prezentat scăderea timpului de golire gastrică și de tranzit intestinal, comparativ cu șobolanii martor (Fig. 1a-b (GE)). Golirea gastrică a fost redusă cu 41% în experimentul acut cu tilacoidul (P = 0,02) și cu 34% în studiul de două săptămâni cu supliment de tilacoidP = 0,08, nesemnificativ), comparativ cu condițiile de control.

dietetice

Tranzitul intestinal, măsurat pe măsură ce distanța albastrului Evans a migrat pe tractul intestinal în decurs de 30 de minute, a fost, de asemenea, redus prin suplimentarea cu tilacoid, însă nu în mod semnificativ (Fig. 1 c-d (Mi)). Migrația a fost redusă după suplimentarea cu tilakoid atât în ​​experimentul acut cu tilacoid (P = 0,08) și după studiul de două săptămâni privind suplimentarea cu tilacoid (P = 0,05). Suplimentarea cu tilacoid nu a avut niciun efect asupra concentrației plasmatice a CCK (P = 0,62) după dozele de bolus date în studiul acut (Fig. 2). Concentrațiile plasmatice nu au fost măsurate în studiul de suplimente dietetice de două săptămâni, deoarece CCK a fost eliberat ca răspuns la nutrienți și în acest studiu nu am controlat când șobolanii și-au consumat mâncarea.

Efect asupra concentrației plasmatice a CCK 60 min după o doză în bolus de tilacoid suplimentat HFD vs. control HFD (control n = 6, tilacoid n = 8 șobolani). Barele reprezintă media + SEM. Nu s-a observat nicio diferență statistică între șobolani tratați cu tilacoid și martori

Efectele gastrointestinale ale suplimentării zilnice cu tilacoide timp de trei luni

Conținutul de grăsime din probele de fecale umane nu s-a modificat dinaintea intervenției dietetice, nici în grupurile de tilacoid, nici în cele de control (Fig. 3). Adăugarea tilacoidelor a afectat însă cantitatea și compoziția florei microbiene intestinale. Cuantificarea bacteriilor din probele de fecale umane a arătat o creștere semnificativă a numărului total de copii ale genei 16S rRNA după consumarea tilacoidelor timp de trei luni comparativ cu înainte de intervenție (P = 0,03). În plus, în grupul tilacoid cantitatea de gene ARNr 16S specifice pentru B. fragilis grupul a fost semnificativ mai mare după (P = 0,002), comparativ cu înainte de intervenție, în timp ce nu s-au găsit diferențe semnificative pentru grupul de control (Tabelul 2). Nu s-au găsit diferențe semnificative nici în grupul de tip tilacoid, nici în cel de control în ceea ce privește numărul de copii ale genei 16S rRNA A. mucinifilia-ca bacteriile, C. coccoides grup, C. leptum subgrup, Enterobacteriaceae sau Lactobacillus la punctul final comparativ cu valoarea inițială (Tabelul 2).

Conținutul de grăsime din probele de fecale obținute de la femeile supraponderale înainte și după perioada de trei luni de supliment alimentar cu tilacoizi (n = 17) sau placebon = 16). Nu a fost găsită nicio diferență semnificativă între înainte și după studiu în niciunul dintre grupuri. Barele reprezintă media + SEM

Discuţie

Prezentul studiu demonstrează că adăugarea tilacoidelor în dietă scade golirea gastrică și timpul de tranzit intestinal, precum și prezintă efecte minore asupra cantității și compoziției microbiotei intestinale. Mai mult, conținutul de grăsime fecală nu a fost afectat de suplimentarea cu tilacoid timp de trei luni.

Consumul de tilacoizi pentru o perioadă mai lungă de timp s-a dovedit anterior că scade greutatea corporală la om [12], precum și scade creșterea în greutate corporală și cantitatea de greutate corporală la rozătoare [9, 10]. De asemenea, s-a constatat că tilacoidele afectează evaluările subiective ale dorinței și plăcerii pentru alimente, precum și evaluările foamei, sațietății și poftei de mâncare gustoasă [12-15, 23], toate acestea putând fi explicate prin efecte asupra reglării apetitului hormoni menționați mai sus. Efectul fiziologic descris aici al unei goliri gastrice reduse, împreună cu o secreție crescută de hormoni precum GLP-1 și CCK, ar duce la o senzație crescută de sațietate. La rândul său, acest lucru ar putea reduce aportul de alimente și, prin urmare, poate favoriza pierderea în greutate corporală [27-29]. Prezentul studiu care arată o scădere a golirii gastrice și a tranzitului intestinal după suplimentarea cu tilacoid, totuși nu într-un mod semnificativ, aduce o explicație mecanicistă nouă rezultatelor obținute anterior în zona de cercetare a apetitului pentru tilacoide.

Eșantioanele de fecale umane recoltate înainte și după tilakoid sau suplimentarea dietetică de control timp de trei luni, au arătat că suplimentarea cu tilacoid nu are nicio influență asupra absorbției intestinale totale a lipidelor dietetice. Deoarece tilacoidele au o afinitate atât pentru complexul lipază/co-lipază, cât și pentru trigliceride [7, 30], s-a discutat dacă tilacoidele ar putea avea aceleași efecte secundare gastrointestinale, cum ar fi steatoreea, după cum s-a arătat după tratamentul cu orlistat [5]. S-a demonstrat anterior că cantitatea de grăsime fecală nu este afectată la șobolanii tratați cu HFD cu sau fără supliment de tilacoid timp de 10 zile [22]. Prezentul studiu este totuși primul studiu care studiază conținutul de grăsimi fecale după administrarea pe termen lung de tilacoizi la om. Rezultatele acestui studiu, care nu arată diferențe în cantitatea de grăsime fecală dintre tilakoid și martor, confirmă rezultatele studiilor anterioare care arată că tilacoidele inhibă activitatea lipazei într-un mod reversibil [7, 22, 30, 31]. În consecință, putem spune cu certitudine că tratamentul cu tilacoid nu provoacă efecte secundare gastrointestinale, cum ar fi steatoreea, care sunt frecvente pentru alți inhibitori ai lipazei [5].

În timpul intervenției umane de trei luni publicată anterior în Appetite, toți subiecții și-au redus greutatea corporală. Cu toate acestea, prezentul studiu include doar 34 de femei din cele 36 inițiale înscrise în studiul anterior [12]. Diferențele găsite în microbiota intestinală între tilacoid și grupul martor ar putea fi astfel cauzate de modificări ale greutății corporale, dar din studiul anterior au arătat și modificări ale hormonilor de reglare a apetitului, propunem că este invers, deoarece o s-a demonstrat că microbiota are ca rezultat creșterea secreției de SCFA, PYY și GLP-1, datorită fermentației colonului [2, 32]. Studiile anterioare care descriu efectele tilacoidelor au arătat o cantitate scăzută de colesterol, creșterea secreției de hormoni de sațietate și o scădere semnificativă în greutate [12, 13]. Prin urmare, propunem că și microbiota intestinală se coroborează în explicațiile mecaniciste pentru aceste rezultate.

Concluzie

În concluzie, prezentul studiu descrie o scădere a timpului de golire gastrică și de tranzit intestinal după administrarea de tilacoizi la șobolani. Chiar dacă toate rezultatele nu sunt dovedite în mod semnificativ, rezultatele se adaugă explicației mecaniciste la modificările observate anterior în hormonii de reglare a poftei de mâncare după aportul de tilacoid. Fie că golirea gastrică întârziată este o cauză sau o consecință a scăderii nivelurilor de peptide care afectează foamea și a nivelurilor crescute de peptide care afectează sațietatea și recompensa în studiile anterioare, rămâne fără răspuns. Mai mult, rezultatele arată că consumul de tilacoid nu provoacă steatoree și că aportul de tilacoid promovează o modificare minoră a microbiotei intestinale. Schimbarea minoră a compoziției microbiene poate fi cauzată de scăderea în greutate, dar propunem că scăderea în greutate este consecința schimbării microflorei combinată cu schimbarea hormonilor de reglare a apetitului, așa cum s-a arătat în studiile anterioare. Împreună cu efectele anterioare ale consumului de tilacoizi, propunem tilacoidele ca un supliment natural promițător pentru gestionarea greutății, fără efecte secundare cunoscute, acționând pentru a afecta digestia, metabolismul și ducând la obiceiuri alimentare sănătoase.