Centrul de Afiliere pentru Cercetări Musculo-Scheletice, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii, Școala de Medicină și Stomatologie, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii

vindecarea

Centrul de afiliere pentru cercetări musculo-scheletice, Universitatea din Rochester Medical Center, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii

Centrul de Afiliere pentru Cercetări Musculo-Scheletice, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Patologie și Medicină de Laborator, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii

Centrul de Afiliere pentru Cercetări Musculo-Scheletice, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Biostatistică și Biologie Computațională, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii

Centrul de afiliere pentru cercetarea musculo-scheletică, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Ortopedie și Reabilitare, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Inginerie Biomecanică, Universitatea din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii

Centrul de afiliere pentru cercetarea musculo-scheletică, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Ortopedie și Reabilitare, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii

Centrul de afiliere pentru cercetarea musculo-scheletică, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Ortopedie și Reabilitare, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii

Centrul de Afiliere pentru Cercetări Musculo-Scheletice, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Patologie și Medicină de Laborator, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii

Centrul de Afiliere pentru Cercetări Musculo-Scheletice, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Patologie și Medicină de Laborator, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii

Centrul de afiliere pentru cercetarea musculo-scheletică, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Ortopedie și Reabilitare, Centrul Medical al Universității din Rochester, Rochester, New York, Statele Unite ale Americii

  • Matthew L. Brown,
  • Kiminori Yukata,
  • Christopher W. Farnsworth,
  • Ding-Geng Chen,
  • Hani Awad,
  • Matthew J. Hilton,
  • Regis J. O'Keefe,
  • Lianping Xing,
  • Robert A. Mooney,
  • Michael J. Zuscik

Cifre

Abstract

Introducere

Vindecarea afectată și neunirea fracturilor scheletice reprezintă o problemă majoră de sănătate publică, cu morbiditate agravată la pacienții cu diabet zaharat (DM). DM este răspândită în întreaga lume și afectează aproximativ 25,8 milioane de adulți din SUA, cu> 90% având DM de tip 2 legată de obezitate (T2DM). În timp ce vindecarea fracturilor în DM de tip 1 (T1DM) a fost studiată folosind modele animale, nu a fost încă efectuată o investigație privind vindecarea întârziată la un model animal de T2DM.

Metode

Șoarecii masculi C57BL/6J la vârsta de 5 săptămâni au fost plasați fie pe o dietă slabă de control, fie pe o dietă experimentală bogată în grăsimi (HFD) timp de 12 săptămâni. O fractură de tibie deschisă mid-diafizară a fost indusă la vârsta de 17 săptămâni și un ac spinal a fost utilizat pentru fixarea intra-medulară. Șoarecii au fost sacrificați în zilele 7, 10, 14, 21, 28 și 35 pentru tomografie micro-computerizată (μCT), histomorfometrie bazată pe histologie și analize moleculare și teste biomecanice.

Rezultate

Șoarecii hrăniți cu HFD au prezentat o greutate corporală crescută și o toleranță redusă la glucoză, ambele caracteristice T2DM. În comparație cu șoarecii martor, șoarecii hrăniți cu HFD cu fracturi de tibie au arătat semnificativ (p 90% din toți pacienții cu diabet zaharat [10]. Pacienții cu T2DM, care anterior a fost denumit diabet non-insulino-dependent (NIDDM) sau diabet cu debut la adulți, au niveluri ridicate de glucoză din sânge secundare insensibilității la insulină și deficit relativ de insulină. Important, deși T2DM are și o componentă genetică, a fost asociat mai mult cu obezitatea și consumul unei diete bogate în grăsimi, bogată în grăsimi nesaturate. oportunitatea de a atenua incidența, prevalența și povara societală a T2DM în general.

Modelele de rozătoare de vindecare a fracturilor în diabet s-au concentrat asupra T1DM, care a fost fie cauzată de o distrugere autoimună a celulelor β pancreatice, fie a fost indusă prin administrarea de streptozotocină (STZ) către aceste celule. Studiile de reparare a fracturilor la aceste modele de T1DM au condus la descoperirea mai multor defecte la nivel de țesut care modifică programul normal de vindecare osoasă. Vindecarea normală a oaselor implică recrutarea și proliferarea populațiilor de celule stem la locul leziunii, angajamentul condrogen și diferențierea cartilajului, formarea osului țesut și remodelarea calusului mediată de osteoclast [11], [12] [11], [12]. În T1DM, există dovezi privind scăderea proliferării celulelor progenitoare [13] - [17], scăderea conținutului de cartilaj calus [13], [14], [17], [18], resorbție prematură a cartilajului [13], [18], [19], scăderea conținutului osului calos [14] - [16], [20], [21] și repararea biomecanic inferioară [14] - [17], [20]. Mai multe grupuri au demonstrat că administrarea de insulină sistemică suficientă pentru a obține un control strict al glucozei a salvat proliferarea celulelor progenitoare, conținutul osului calos și rezistența biomecanică [15], [16], [20]. Alternativ, administrarea de insulină intramedulară a salvat scăderea proliferării celulare, a procentului de cartilaj, a procentului osos și a rezistenței mecanice care caracterizează fractura calusului la șobolanii diabetici [14].

Chiar dacă T2DM este o afecțiune mult mai răspândită și în creștere în comparație cu T1DM, evenimentele tisulare și moleculare care afectează vindecarea fracturilor în T2DM nu au fost investigate. Aici, pentru prima dată, examinăm vindecarea fracturii tibiei la un șoarece alimentat cu diete bogate în grăsimi, un model clasic de T2DM. Rezultatele noastre demonstrează că dereglarea metabolică în acest model este asociată cu repararea defectuoasă a fracturii, care este distinctă de cea observată în T1DM și este probabil legată de o creștere aberantă a adipocitelor în calusul fracturii la șoareci cu T2DM.

Materiale și metode

Animale

Modelul fracturii tibiei

Tomografie micro-computerizată și analiză microvasculară

Histologie și histomorfometrie

Cuantificarea osteoclastelor

O secțiune pe probă a fost colorată pentru fosfatază acidă rezistentă la tartrat (TRAP). Pe scurt, după deparafinare și rehidratare cu apă distilată, secțiuni au fost incubate la 37 ° C timp de 25 de minute într-o soluție de acetat de sodiu anhidru (Sigma S-2889), acid L - (+) tartric (Sigma T-6521), acetic glacial acid, sare LB violet roșu rapid (Sigma F-3381), fosfat de naftol AS-MX (Sigma N-4875), eter etilen glicol monoetil eter (Sigma E-2632) și apă distilată. Secțiunile au fost clătite în apă distilată, contracolorate cu hematoxilină timp de 10 sec și apoi plasate în apă de amoniac timp de 5 secunde. Cuantificarea a fost finalizată utilizând obiectivul 10x și software-ul Osteomeasure (OsteoMetrics, Inc., Decatur, GA, SUA) pentru a contura perimetrul osos (B.Pm.) în calusul anterior și a identifica osteoclastele (Oc.N.), care au fost definite celule multi-nucleate, TRAP-pozitive așezate pe suprafețele osoase.

Colorarea imunohistochimică

Imunohistochimia a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [35]. Pe scurt, un sistem avidin-biotină peroxidază (Vector Lab, Burlingame, CA, SUA) a fost utilizat pentru a detecta doi anticorpi primari; anticorp monoclonal de iepure anti-perilipină (1∶100: Cat. # 9349: Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA) și anticorp monoclonal de iepure anti-PPARγ (1∶100: Cat. # 2435: Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). Reacțiile au fost apoi vizualizate cu diaminobenzidină (DAB) ca substrat (Vector Lab, Burlingame, CA, SUA). Secțiunile au fost contracolorate cu hematoxilină. Toate procedurile de colorare au fost urmate conform instrucțiunilor producătorului.

Testarea biomecanică

Proprietățile biomecanice ale fracturilor vindecate au fost evaluate la 14 și 35 de zile postoperator, după cum s-a descris anterior [36]. Pe scurt, tibiile drepte au fost recoltate, congelate imediat în azot lichid și apoi depozitate la -80 ° C. Înainte de testare, probele au fost decongelate timp de 30 de minute la RT și trimise pentru scanare μCT. După μCT, cimentul osos de polimetilmetacrilat (PMMA) (Endurance Cement; Depuy Orthopedics, Inc., Varșovia, IN) a fost utilizat pentru a cimenta tibiile în manșoane de aluminiu pătrate de 6,35 mm 2, având grijă să aliniați axa lungă a fiecărei tibii cu centrul manșonului de rotație. Probele au fost rehidratate și încărcate într-un sistem EnduraTec TestBench ™ (celulă de cuplu de 200 Nmm; Bose Corporation, Minnetonka, MN, SUA) și testate în torsiune la o rată de 1 °/s până la eșec. Datele cuplului au fost reprezentate grafic împotriva deformării rotaționale și cuplul maxim la punctul de defecțiune a fost înregistrat pentru fiecare probă. Toate probele au fost orbite pe parcursul pregătirii și testării.

Analize statistice

Datele prezentate reprezintă eroarea medie și standard pentru șoarecii slabi și hrăniți cu HFD, dacă nu se specifică altfel. Testele t ale studentului, cu două cozi, nepereche, au fost calculate utilizând software-ul Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, SUA). Testele ANOVA bidirecționale au fost calculate utilizând software-ul GraphPad PRISM (GraphPad Software, La Jolla, CA, SUA). Semnificația este indicată folosind asteriscuri; * p Figura 1. Șoarecii hrăniți cu HFD sunt obezi și intoleranți la glucoză.

(A) Greutatea corporală a șoarecilor hrăniți cu HFD și controlează șoarecii slabi alimentați cu diete în diferite momente de timp după fractura chirurgicală. Barele reprezintă media ± SEM (n≥5). *** p Figura 2. Neovascularizarea calusului la șoarecii hrăniți slabi și HFD este similară.

Scanările μCT ale tibiilor fracturate care au fost perfuzate cu vopsea cu cromat de plumb după decalcifiere au fost efectuate la șoareci slabi și hrăniți cu HFD la 10 și 14 zile după fractură. Reconstrucțiile tridimensionale reprezentative sunt prezentate în panou (A). Volumul vascular (B) și volumul vascular normalizat la volumul osos calus (C) a fost cuantificată din datele μCT. Barele reprezintă media ± SEM (n≥5). Bara de măsurare (linia albă) = 1 mm.

Șoarecii hrăniți cu HFD prezintă un conținut scăzut de os calus fractural în vindecarea în stadiu târziu

Volumul osos al fracturii calusului a fost determinat prin studii μCT efectuate în diferite momente de timp în timpul vindecării. Reconstrucțiile reprezentative ale μCT sunt prezentate pentru toate punctele de timp (Fig. 3), cuantificarea corelată indicând scăderea semnificativă a volumului osos în ziua 21 și o întârziere aparentă în atingerea volumului osos maxim și la șoarecii hrăniți cu HFD comparativ cu martorii hrăniți slab. ). Secțiunile histologice colorate cu hematoxilină albastră Alcian/portocaliu G (Fig. 5A) au fost utilizate pentru a efectua un studiu bazat pe histomorfometrie al calului, care nu a evidențiat diferențe în conținutul de cartilaj între grupuri la orice punct de timp (Fig. 5B), dar confirmând scăderea conținutului osos, cu șoareci hrăniți cu HFD care prezintă o scădere semnificativă a ariei osoase țesute ca procent din aria totală a calusului în ziua 28 (Fig. 5C). Interesant este că șoarecii hrăniți cu HFD au prezentat o scădere semnificativă a zonei stromale în ziua 35, ceea ce se poate datora extinderii populației de adipocite cu posibilă supresie a celulelor stem ale măduvei osoase și/sau a altor populații de progenitori sau celule stromale (Fig. 5D). Trebuie remarcat faptul că s-a efectuat colorarea TRAP pentru a examina raportul dintre numărul osteoclastelor și perimetrul osului, indicând faptul că raportul dintre numărul osteoclastelor (Oc.N.) și perimetrul osului (B.Pm.) nu a fost diferit între slab și Șoareci alimentați cu HFD în orice moment (datele nu sunt prezentate).

Scanările μCT au fost efectuate pe tibii la 7, 10, 14, 21, 28 și 35 de zile după fractură. Reconstrucții tridimensionale reprezentative, din grupuri de 5-7 tibii, arată volumul osos în calusul fracturii externe. Bara de măsurare (linia albă) = 1 mm. Siturile de fractură sunt notate cu săgeți galbene.

Folosind scanări μCT care au fost utilizate pentru a crea reconstrucțiile prezentate Fig. 3, volumul osos a fost cuantificat de la șoareci hrăniți slabi și HFD la 7, 10, 14, 21, 28 și 35 de zile după fractură. Barele reprezintă media ± SEM (n≥5). * p Figura 5. Conținutul osului țesut este scăzut în etapele ulterioare ale vindecării fracturilor la șoarecii hrăniți cu HFD.

(A) Secțiuni histologice colorate reprezentative ale hematoxilinei albastre Alcian/G portocalie ale fracturii de calus la șoareci hrăniți slab și HFD la 7, 10, 14, 21, 28 și 35 de zile după fractură. Cuantificarea cartilajului (B), os țesut (C), și zonele celulare stromaleD), exprimate ca procente din aria totală a calusului, au fost determinate utilizând o metodă histomorfometrică de numărare a punctelor. Barele reprezintă media ± SEM (n≥5). *** p Figura 6. Adipozitatea este crescută și suprafața osoasă ocupată de osteoblasti este scăzută în calusul fracturii externe în timpul vindecării în stadiu târziu la șoarecii alimentați cu HFD.

Colorarea imunohistochimică a perilipinei a fost efectuată pentru a confirma prezența adipocitelor în fractura calusului. Secțiunile reprezentative din ziua 21 post-fractură demonstrează un număr crescut de adipocite în calusul de fractură al șoarecului alimentat cu HFD (B) comparativ cu controlul dietei slabe (A). Măriri mai mari ale regiunilor selectate din caluri slabe și hrănite cu HFD ilustrează specificitatea colorării perilipinei, cu mai multe adipocite tipice perilipin-pozitive denotate cu săgeți roșii. (C) Suprafața adipocitelor ca procent din suprafața totală a calusului și procentul suprafeței osoase ocupate de osteoblast a fost determinată utilizând metode histomorfometrice la șoareci hrăniți slabi și HFD la momentele indicate. Barele reprezintă media ± SEM (n≥5). ** p Figura 7. Expresia PPARγ este crescută în calusul de fractură al șoarecilor hrăniți cu HFD.

Secțiunile au fost supuse colorării imunohistochimice pentru PPARγ și calusurile reprezentative ale fracturilor în ziua 14 arată o expresie crescută a PPARγ în calusul fracturii la șoarecii hrăniți cu HFD (B) în comparație cu controalele slabe (A), în special în celulele adiacente elementelor osoase trabeculare (marcate de săgeți albastre în calus de la șoareci hrăniți slab și săgeți roșii în calus de la șoareci hrăniți cu HFD). Marcatorul de dimensiuni negre (panou B) = 20 um.

Puterea biomecanică în timpul vindecării în stadiu târziu a fost scăzută la șoarecii hrăniți cu HFD

Testarea torsională a fost efectuată pe tibiile fracturate chirurgical în zilele 14 și 35. Șoarecii alimentați cu HFD au avut fracturi vindecate semnificativ mai slabe în ziua 35 (Fig. 8), dar nu s-a observat nicio diferență între cuplul maxim și eșec în ziua 14. Această constatare corespunde cu datele noastre care nu prezintă diferențe în ceea ce privește procentul de os țesut sau adipocite între șoareci alimentați cu HFD și șoareci cu dietă slabă până în ziua 21.

Datele prezentate în acest raport susțin conceptul că adipogeneza și osteoblastogeneza sunt corelate în contextul reparării fracturilor. În mod normal, există un echilibru între aceste destine în timpul vindecării, iar soarta osteoblastului este rezultatul dominant. Angajamentul osteoblastic susține formarea osoasă țesută și producția în aval de factori produși de osteoblasti, cunoscuți pentru reglarea formării osteoclastelor (RANKL și osteoprotegerină) și a remodelării calusului. Pe baza constatărilor noastre, propunem că echilibrul diferențierii celulelor progenitoare este parțial deplasat către linia de adipocite la șoarecii hrăniți cu HFD. Acest lucru are ca rezultat o creștere a formării adipocitelor și o scădere asociată a angajamentului osteoblastelor. Pe baza constatărilor imunohistochimice, propunem că expresia crescută a PPARγ poate contribui la această soartă modificată pentru celulele progenitoare, ducând la defectul de vindecare observat la populația hrănită cu HFD.