Aniello Primiano

1 Universitatea Catolică a Inimii Sacre, Roma, Italia

2 Fundația Policlinică Universitară Agostino Gemelli IRCCS, Roma, Italia

Silvia Persichilli

1 Universitatea Catolică a Inimii Sacre, Roma, Italia

2 Fundația Policlinică Universitară Agostino Gemelli IRCCS, Roma, Italia

Pietro Manuel Ferraro

1 Universitatea Catolică a Inimii Sacre, Roma, Italia

2 Fundația Policlinică Universitară Agostino Gemelli IRCCS, Roma, Italia

Riccardo Calvani

2 Fundația Policlinică Universitară Agostino Gemelli IRCCS, Roma, Italia

Alessandra Biancolillo

3 Departamentul de Științe Fizice și Chimice, Università degli Studi dell'Aquila, L'Aquila, Italia

Federico Marini

4 Departamentul de chimie, Sapienza Università di Roma, Roma, Italia

Anna Picca

2 Fundația Policlinică Universitară Agostino Gemelli IRCCS, Roma, Italia

Emanuele Marzetti

1 Universitatea Catolică a Inimii Sacre, Roma, Italia

2 Fundația Policlinică Universitară Agostino Gemelli IRCCS, Roma, Italia

Andrea Urbani

1 Universitatea Catolică a Inimii Sacre, Roma, Italia

2 Fundația Policlinică Universitară Agostino Gemelli IRCCS, Roma, Italia

Jacopo Gervasoni

1 Universitatea Catolică a Inimii Sacre, Roma, Italia

2 Fundația Policlinică Universitară Agostino Gemelli IRCCS, Roma, Italia

Date asociate

Toate datele sunt disponibile în articol.

Abstract

fundal

Urolitiaza este procesul de formare a pietrei în tractul urinar. Etiologia sa este doar parțial cunoscută, iar abordările terapeutice eficiente lipsesc în prezent. Metabolomica este din ce în ce mai utilizată în descoperirea biomarkerilor pentru capacitatea sa de a identifica mediatori ai proceselor fiziologice relevante (patologice). Aminoacizii pot fi implicați în formarea calculilor renali. Scopul prezentului studiu a fost investigarea prezenței unei semnături de aminoacizi în urina de piatră, printr-o abordare metabolomică țintită.

Metode

Un grup de 35 de aminoacizi și derivați a fost evaluat în urină de la 15 foști pacienți cu piatră și 12 subiecți sănătoși prin UPLC-MS. Analiza discriminatorie parțială a celor mai mici pătrate (PLS-DA) a fost utilizată pentru a defini profilurile de aminoacizi ale cazurilor și controalelor. Rezultate si discutii. Abordarea noastră a condus la definirea unei amprente specifice de aminoacizi la persoanele cu pietre la rinichi. Un profil urinar de aminoacizi al formatorilor de piatră a fost caracterizat prin niveluri mai scăzute de acid α-aminobutiric, asparagină, etanolamină, izoleucină, metionină, fenilalanină, serină, triptofan și valină. Analiza metabolomică poate oferi informații despre fiziopatologia urolitiazei și permite urmărirea acestei condiții predominante în timp.

1. Introducere

Metabolomica este studiul moleculelor mici prezente într-o celulă, țesut sau organism care rezultă din procesele metabolice care au loc atât în ​​condiții fiziologice, cât și patologice [14]. Prin urmare, metabolomica a devenit o abordare de bază în descoperirea biomarkerilor și pentru dezvoltarea unor strategii de medicină personalizate [15].

Atât abordările metabolomice țintite, cât și cele neintenționate au fost utilizate în cercetarea nefrologică pentru a identifica markeri noi ai bolii renale și complicațiile acesteia [16-18]. Recent, un studiu metabolomic bazat pe RMN a constatat că patru căi metabolice, inclusiv metabolismul glioxilat și dicarboxilat; metabolismul glicinei, serinei și treoninei; metabolismul fenilalaninei; și ciclul citratului (ciclul TCA), au fost strâns asociate cu calculii renali [19].

Scopul prezentei investigații a fost de a determina profilul de aminoacizi al unui grup de pacienți cu urolitiază și controale sănătoase printr-o metodă UPLC-MS țintită cuplată cu analize chimiometrice multivariate. Această abordare poate oferi perspective noi asupra rolului jucat de metabolismul proteinelor/aminoacizilor în formarea calculilor renali și a biomarkerilor candidați pentru diagnosticul precoce al urolitiazei.

2. Material și metode

2.1. Participanții la studiu

Acest studiu pilot a fost conceput ca o investigație transversală, control de caz. Pe scurt, după obținerea consimțământului informat scris, au fost recoltate probe de urină de douăzeci și patru de ore de la un grup mic de pacienți spitalizați pentru litiază (formatori de piatră, SF) în Divizia de Nefrologie a Fundației Policlinico Gemelli IRCCS și au fost analizate în Divizia de Laborator Zona de diagnostic. Toți pacienții erau forme recidivante de piatră, fără tratament farmacologic activ în momentul evaluării. Cauzele secundare ale litiazei renale au fost excluse. Pentru pacienții care au fost supuși recent unei proceduri endourologice sau îndepărtării stentului ureteral, evaluarea metabolică a fost efectuată după cel puțin 3 săptămâni de procedură. Subiecții sănătoși fără antecedente de calculi renali sau probleme urologice majore au fost luați ca martori (CNT). După colectare, toate alicotele urinare au fost stocate imediat la -80 ° C până la analiză.

2.2. Produse chimice și reactivi

Standardele de aminoacizi au fost achiziționate de la Sigma (Saint Louis, MS, SUA). Standardele de aminoacizi marcate izotopic provin de la Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, SUA). Concentratele elucente AccQ-Tag Ultra și un kit de ultraderivatizare AccQ-Tag au fost achiziționate de la Waters Corporation (Milford, MA, SUA). Acetonitrilul provenea din (Merck KGaA, Germania). Apa deionizată provenea din (Merck KGaA, Germania).

2.3. Determinarea aminoacizilor

3. Analiza datelor statistice

3.1. Analiza univariată

Comparațiile între SF și CNT pentru variabilele continue distribuite în mod normal au fost efectuate prin statistici de testare t. Testul Mann-Whitney U a fost aplicat pentru a cuantifica diferențele pentru datele continue distribuite în mod normal.

Analizele descriptive au fost efectuate utilizând software-ul GraphPrism 5.03 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), cu o semnificație statistică stabilită la p Tabelul 1. Formatorii de piatră și martorii au fost diferiți în funcție de vârstă și compoziția corpului/IMC; din acest motiv, am investigat pe larg dacă acest lucru ar putea duce la o prejudecată importantă pentru rezultate sau nu, colectând suficiente dovezi care să permită excluderea unei astfel de posibilități (vezi figurile S1, S2 și S3).

tabelul 1

Principalele caracteristici ale persoanelor implicate în studiu, în funcție de prezența urolitiazei.

CNT (n = 12) SF (n = 15)
Bărbat (n (%))4 (47)9 (60)
Vârstă32 (21-56)57 (30-70)
IMC (kg/m 2)20,9 (17,6-26,0)25,1 (21,3-36,3)

Datele sunt exprimate ca mediană (valoare min-max) pentru variabilele continue și numărare (%) pentru cele categorice. Abrevieri: IMC: indicele de masă corporală; CNT: controale; SF: formatori de piatră.

Un model dublu PLS-DA validat încrucișat a fost rulat pentru a evalua prezența unui profil distinct de aminoacizi la persoanele cu litiază renală în comparație cu pacienții martor. Cel mai bun model PLS-DA a fost construit folosind două LV-uri. O performanță bună de clasificare a fost obținută de modelul PLS-DA selectat. Într-adevăr, am reușit să clasificăm corect 84,2 ± 3,6% dintre participanții la studiu (82,2 ± 4,7% din cazuri și 86,7 ± 4,7% din controale) în bucla DCV internă utilizată pentru selectarea modelului și 75,7 ± 3,2% (76,0 ± 5,1% ) din cazuri și 75,3 ± 4,1% din controale) în bucla DCV exterioară, care rezultă din cicluri repetate de pași de validare externă. Diferențele în profilurile de aminoacizi ale cazurilor și controalelor, precum și performanța evidentă de clasificare a modelului PLS-DA sunt evidente la inspectarea proiecției scorurilor participanților la studiu pe spațiul parcurs de VS (Figura 1).

urinari

Scorul grafic care arată separarea participanților (formatori de piatră în verde; controale sănătoase în roșu) pe spațiul determinat de LV-uri conform modelului PLS-DA. LV: variabilă latentă; PLS-DA: analiză parțială cel puțin pătrat-discriminant.

VIP și RP au fost utilizate pentru a detecta care aminoacizi contribuie cel mai mult la soluționarea problemei de clasificare. Primii nouă biomarkeri detectați de cele două abordări sunt aceiași, indicând că acești analiți caracterizează cu siguranță starea de nefrolitiază. În special, formatorii de piatră au prezentat niveluri mai scăzute de acid α-aminobutiric, asparagină, etanolamină, izoleucină, metionină, fenilalanină, serină, triptofan și valină, decât martorii sănătoși (Tabelul 2).

masa 2

Nivelurile medii de urină de aminoacizi discriminanți la pacienți și grupul de control.

Valoarea p AACNTSFMedia ± SD Medie ± SD
Acid α-aminobutiric14.05.86.12.5 Figura 2). Rezultatul acestei investigații suplimentare este că rezultatele obținute de modelul PLS-DA sunt semnificative statistic. De fapt, inspectând Figura 2, este clar că, indiferent de cifra de merit investigată, rezultatele oferite de modelul de clasificare a datelor reale (nepermise) (cercuri roșii) cad pe marginea distribuției nule a ipotezelor, ducând la p valori de 0,026, 0,009 și 0,016 pentru NMC, AUROC și respectiv DQ2.

Valorile obținute pe setul de date real (cercuri roșii) nu se încadrează în distribuția de ipoteză nulă corespunzătoare (histograme albastre), corespunzătoare unui p (140K, docx)