Departamentul de afiliere pentru biochimie și biologie celulară, Universitatea Stony Brook, Stony Brook, New York, Statele Unite ale Americii

zidul

Departamentul de afiliere pentru biochimie și biologie celulară, Universitatea Stony Brook, Stony Brook, New York, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Afiliere pentru Neurobiologie și Comportament, Centrul pentru Genetica Dezvoltării, Universitatea Stony Brook, Stony Brook, New York, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru biochimie și biologie celulară, Universitatea Stony Brook, Stony Brook, New York, Statele Unite ale Americii

  • Alison E. Coluccio,
  • Rachael K. Rodriguez,
  • Maurice J. Kernan,
  • Aaron M. Neiman

Cifre

Abstract

În natură, drojdiile sunt supuse prădării de către muștele din genul Drosophila. Ca răspuns la înfometarea nutrițională, Saccharomyces cerevisiae se diferențiază într-un tip de celulă latentă, denumită spor, care este rezistentă la multe tipuri de stres de mediu. Rezistența la stres a sporilor se datorează în primul rând unui perete de spor care este mai elaborat decât peretele celular vegetativ. Raportăm aici că sporii S. cerevisiae supraviețuiesc trecerii prin intestinul Drosophila melanogaster. Pentru această rezistență sunt necesari elementele constitutive ale peretelui sporului care îl deosebesc de peretele celular vegetativ. Ascosporii de drojdie îndepărtată Schizosaccharomyces pombe prezintă, de asemenea, rezistență la digestie de către D. melanogaster. Aceste rezultate sugerează că funcția principală a ascosporului de drojdie este de a fi un tip de celulă specializat pentru dispersarea prin vectori de insecte.

Citare: Coluccio AE, Rodriguez RK, Kernan MJ, Neiman AM (2008) Zidul sporei de drojdie permite sporilor să supraviețuiască trecerea prin tractul digestiv al Drosophila. PLOS ONE 3 (8): e2873. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002873

Editor: Rodolfo Aramayo, Texas A&M University, Statele Unite ale Americii

Primit: 18 martie 2008; Admis: 15 iulie 2008; Publicat: 6 august 2008

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de grantul NIH GM072540 către A. M. N.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

În absența azotului și a prezenței unei surse de carbon nefermentabile, celulele diploide din drojdia Saccharomyces cerevisiae suferă meioză, iar nucleii haploizi rezultați sunt ambalate în spori [1]. Sporii sunt celule în repaus care prezintă rezistență la o varietate de insulte asupra mediului. Sporii S. cerevisiae se caracterizează printr-un strat gros sau perete de spori, care este mai extins decât peretele celular al celulelor vegetative și acest perete de spori este esențial pentru rezistența sporilor la stresul mediului [2]. Peretele sporului este compus din patru straturi de polimeri diferiți [2]. Cele două straturi interioare constau în principal din manoproteine ​​și beta-glucani și sunt similare cu pereții celulelor vegetative [3]. Al treilea și al patrulea strat (cel mai exterior) sunt specifice sporului și sunt compuse, respectiv, din chitosan și dintr-un polimer care conține dityrosine [4], [5]. Rezistența sporită a sporului la multe solicitări este atribuibilă acestor două straturi de perete exterior [6], [7]. În drojdiile hemiascomicete, cum ar fi sporii Saccharomyces, se formează în mod obișnuit într-un set de patru, numit tetrad, care sunt închise într-un sac, numit ascus [8].

Ciupercile filamentoase formează deseori structuri elaborate pentru a ajuta la dispersia condusă de vânt a conidiosporilor (asexuali) sau ascosporilor [9], [10]. Drojdia nu produce astfel de structuri și s-a sugerat că ascosporii sunt mai degrabă o formă de supraviețuire decât o formă de dispersie [9]. Sporii s-au dovedit a fi rezistenți la tratamentele de laborator, cum ar fi expunerea la vapori de eter sau șocul de temperatură la 55 ° C [6], [11], dar relevanța acestor tratamente pentru stresurile din mediul natural nu este clară. Utilizarea drojdiilor ca sursă de hrană de către speciile de Drosophilid în natură este bine documentată [12]. Studiile anterioare de laborator cu S. cerevisiae și D. melanogaster indică faptul că celulele vegetative sunt ucise prin trecerea prin intestin și că sporii au crescut supraviețuirea, dar acest lucru nu a fost riguros cantitativ [13], [14]. Raportăm aici dovezi directe că sporii prezintă o supraviețuire îmbunătățită față de celulele vegetative care trec prin intestinul Drosophila melanogaster și că mutațiile care afectează în mod specific peretele sporilor le reduc rata de supraviețuire. Mai mult, rezistența necesită straturile unice pentru peretele sporei. Aceste date sugerează că ascosporii S. cerevisiae sunt un tip de celulă specializat pentru dispersarea în mediu prin intermediul vectorilor Drosophila.

Rezultate

Sporii sunt rezistenți la stresurile asociate cu prădarea

Deoarece se crede că o funcție a sporilor este aceea de a permite persistența în mediu, am examinat supraviețuirea sporilor într-o varietate de tratamente care imită stresurile naturale. În această analiză, sporii au fost comparați cu celulele vegetative în două faze de creștere: culturi de fază log care conțin celule înmugurite activ și culturi de fază staționară (Figura 1). Celulele de fază staționară oferă o comparație deosebit de bună deoarece, la fel ca sporii, sunt celule neînvârtite, în repaus, dar lipsite de straturile exterioare ale peretelui sporului. Comparativ cu celulele de fază log, sporii au fost mai rezistenți la toate tratamentele de stres. Cu toate acestea, celulele de fază staționară au fost la fel de rezistente ca sporii la unii dintre factorii de stres, în special acele stresuri menite să imite condițiile meteorologice. Celulele de fază staționară au fost la fel de competente ca sporii la ciclurile de îngheț repetat supraviețuitoare și osmolaritatea crescută, fie cu niveluri ridicate de dextroză, fie cu sorbitol. În plus, celulele de fază staționară au fost comparabile cu sporii în testele calitative pentru supraviețuirea desicării (datele nu sunt prezentate).

Supraviețuirea celulelor vegetative dintr-o cultură saturată (Sat), o cultură de fază log (Log) sau spori (Spo) după expunerea la diferite tensiuni a fost măsurată așa cum este descris în Metode. Pentru fiecare afecțiune, au fost efectuate cel puțin trei experimente independente și s-a determinat procentul mediu de supraviețuire. Pentru grafic, rata de supraviețuire a sporilor a fost definită ca 1 și este prezentată supraviețuirea relativă a culturilor vegetative. Liniile subțiri reprezintă intervalul de supraviețuire relativă. Procentul mediu de supraviețuire a sporilor în fiecare afecțiune a fost: 40% dextroză, 60%; β-glucanază, 244%; Acid acetic, 54%; NaOH, 23%; Eter 52%; Înghețați/dezghețați 94%; 2M Sorbitol, 76%; 42 ° C, 73%; NaCl 5M, 51%.

Sporii supraviețuiesc trecerii prin intestinul Drosophila

Pentru a testa această posibilitate, am stabilit un test pentru a cuantifica supraviețuirea S. cerevisiae după ingestie și trecerea prin intestinul muștei fructului D. melanogaster. S-a raportat că intestinul mediu al insectelor are regiuni atât cu pH ridicat, cât și cu pH scăzut [19], condiții care ar putea fi selectate pentru spori peste celulele cu fază staționară (Figura 1). Pentru testul nostru, am construit tulpini în care gena TEF2, care codifică factorul de alungire a traducerii 2a, o proteină citoplasmatică abundentă, a fost marcată cu GFP. Celulele intacte ale acestei tulpini prezintă fluorescență citoplasmatică strălucitoare (Figura 2B). Drosophila a murit de foame timp de șase ore și apoi a fost plasată într-o cutie Petri cu celule de fază staționară sau cu spori purtând reporterul TEF2: GFP. O copertă a fost atașată la capacul cutiei Petri. După 18 ore, foaia de acoperire a fost plasată pe o lamă și fecale individuale (flyspecks) au fost vizualizate direct în microscopul cu fluorescență. Celulele intacte și-au păstrat fluorescența citoplasmatică, în timp ce celulele moarte nu mai erau fluorescente. Această analiză permite cuantificarea supraviețuirii celulare și, deoarece celulele au fost vizualizate direct în fecale (frass), se asigură că acestea au trecut prin intestin, mai degrabă decât să fi fost transferate la capacul de pe exteriorul muștei.

Celulele vegetative sau sporii de tulpină AN390 au fost hrăniți la Drosophila și frassul a fost analizat prin microscopie DIC și fluorescență. A) Imagine DIC a celulelor vegetative înainte de ingestie. B) Imagine de fluorescență a celulelor din A. C) Imagine DIC a unui flyspeck din celule vegetative hrănite cu Drosophila. Săgeata indică o celulă vegetativă intactă. D) Imagine fluorescentă a celulelor din C. E) Imagine DIC a sporilor înainte de ingestie. F) Imagine de fluorescență a sporilor din E. G) Imagine DIC a unui flyspeck din spori alimentați cu Drosophila. H) Imagine de fluorescență a celulelor din G. Bara de scală = 5 microni.

Prin microscopie cu interferență diferențială (DIC), majoritatea celulelor de fază staționară din frass par a fi fantome cu pereții intacti goi de conținut (Figura 2C). În concordanță cu aceasta, celulele fantomă nu au fluorescență citoplasmatică (Figura 2D). Prin contrast, majoritatea sporilor din frass par intactă atât prin DIC, cât și prin fluorescență, indicând faptul că sunt rezistenți la digestie în intestinul zburător (Figura 2G, H). Sporii sunt încă grupați în seturi de trei sau patru, ceea ce sugerează că sporii din asci individuale tind să se țină împreună în timpul trecerii. Cu toate acestea, sacul ascal lipsește în majoritatea cazurilor, indicând faptul că sporii sunt ținuți împreună de podurile interspore care leagă pereții sporilor [20].

Pentru fiecare condiție, imaginile au fost colectate din mai multe flyspecks și procentul de supraviețuire calculat ca fracțiunea celulelor intacte, după cum se judecă prin prezența unui semnal de fluorescență (Tabelul 1). Pentru celulele în fază staționară, procentul de supraviețuire în diferite flyspecks a variat de la Tabelul 1. Cuantificarea supraviețuirii celulare în frass.

Straturile unice ale peretelui sporului sunt necesare pentru supraviețuirea sporilor

Pentru a examina dacă peretele sporei este important pentru rezistența la digestie, au fost examinate tulpinile lipsite de DIT1, OSW1 sau MUM3. DIT1 codifică o enzimă necesară pentru sinteza stratului exterior de ditirozină al peretelui sporului, în timp ce în absența OSW1 sau MUM3 atât stratul de chitosan, cât și cel de ditirozină se pierd [21]. Frass de la muște hrănite spori ai tulpinei dit1 au prezentat o proporție crescută de fantome aparente de spori, care din nou s-au corelat bine cu pierderea fluorescenței citoplasmatice în spori (Figura 3B, D). Cuantificarea a dezvăluit că sporii dit1 au fost mai sensibili decât sporii de tip sălbatic, dar totuși mai rezistenți decât celulele de fază staționară, cu o supraviețuire medie de 30%. Sporii osw1 și mum3 au apărut chiar mai sensibili decât dit1, cu fantomele sporilor dificil de distins și resturile celulare aparente în frass (Figura 3F, H). Supraviețuirea în aceste tulpini, cantitativă pe baza aspectului DIC, mai degrabă decât fluorescența, a fost de doar 3% și, respectiv, 8%, comparabilă cu supraviețuirea celulelor de tip sălbatic în fază staționară (Tabelul 1). Luate împreună, aceste date indică faptul că stratul de dityrosine este important, iar straturile de chitosan și dityrosine împreună sunt esențiale, pentru rezistența sporilor la digestie de către Drosophila.

Sporii mutanți pentru dit1, mum3 sau osw1 au fost hrăniți la Drosophila și frassul a fost analizat prin microscopie DIC și fluorescență. A) Imaginea DIC a sporilor dit1 înainte de ingestie. B) Imaginea DIC a sporilor dit1 în frass. Săgeata indică un spor intact. Capătul săgeții indică un spor lizat. C) Imagine fluorescentă a sporilor din A. D) Imagine fluorescentă a sporilor din B. E) Imagine DIC a sporilor mum3 înainte de ingestie. F) Imaginea DIC a sporilor mum3 după ingestie. G) Imaginea DIC a sporilor osw1 înainte de ingestie. H) Imagine DIC a sporilor osw1 în frass.

Sporii S. pombe rezistă digestiei de către Drosophila

Pentru a determina dacă rezistența la digestie a fost unică pentru sporii S. cerevisiae, am examinat supraviețuirea celulelor vegetative și a ascosporilor de drojdie Schizosaccharomyces pombe. Peretele sporei din S pombe este, de asemenea, mai elaborat decât peretele celular vegetativ și, la fel ca peretele sporei S cerevisiae, conferă rezistență compușilor organici [22] - [24]. Cu toate acestea, pereții spori S. pombe sunt diferiți ca compoziție de S. cerevisiae; de exemplu, deși pot conține chitosan, le lipsește ditirozina [22], [25], [26]. Ca și în S. cerevisiae, celulele vegetative ale S. pombe au fost sensibile la digestie de către Drosophila și sporii au prezentat o supraviețuire crescută (Figura 4), deși în ambele forme, S. pombe a fost oarecum mai sensibilă decât S. cerevisiae la digestie (Tabelul 1) . Aceste rezultate sugerează că rezistența la digestie este o caracteristică comună a ascosporilor de drojdie și crește posibilitatea ca S. cerevisiae să fie oarecum mai bine adaptată pentru dispersare de D. melanogaster decât S. pombe.

Celulele vegetative sau sporulate ale tulpinii YDM124 au fost alimentate la Drosophila și flyspecks au fost analizate prin microscopie cu lumină. A) Celule vegetative înainte de ingestie. B) Celule vegetative în frass. Săgeata indică o celulă intactă. C) Spori înainte de ingestie. D) Spori și frass. Săgeata indică un spor intact. Capătul săgeții indică un spor lizat.

S. cerevisiae gene necesare supraviețuirii în intestin

Dacă peretele sporului a fost adaptat în mod special pentru rezistența la digestie, ne-am putea aștepta să găsim gene care sunt necesare pentru rezistența la digestie, dar care nu sunt necesare pentru rezistența la alte tensiuni. Pentru a examina această posibilitate, am examinat tulpinile de drojdie dintr-o colecție ștearsă pentru gene induse transcripțional în timpul sporulării [27]. Această colecție a fost analizată anterior pentru mutanți care efectuează segregarea cromozomilor meiotici, formarea sporilor și rezistența la eteri [21], [27]. Am analizat 50250 tulpini individuale. Fiecare tulpină a fost sporulată și sporii au fost alimentați la Drosophila. Datorită variabilității supraviețuirii sporilor de tip sălbatic în diferite flyspecks, mai multe flyspecks au fost examinate prin microscopie DIC pentru fiecare mutant și supraviețuirea a fost cuantificată prin numărarea raportului dintre sporii intacti și sporii fantomă. Toate tulpinile care au fost raportate anterior ca fiind defecte în formarea sporilor [27] au fost foarte sensibile la digestie. În mod similar, mutanții cu defecte raportate anterior în peretele sporului [21], cum ar fi osw1 și mum3, au fost sensibili la trecerea prin intestin.

Am fost interesați în special de tulpini în care nu au fost observate defecte evidente în ecranele anterioare. Aproximativ 20 de astfel de tulpini mutante au prezentat o supraviețuire scăzută (+/TEF2: GFP: his5 +) și AN391 (MATA/ MATα ura3/ura3 his3/his3 TEF2: GFP: his5 +/TEF2: GFP: his5 + dit1: his5 +/dit1: his5 +) au fost construite prin încrucișarea unui TEF2: GFP etichetat MATA tulpina [38] la haploizi AN117-4B [39] și AN263-5A (ca AN117-4B, plus dit1: his5 +) în fundalul SK-1 cu sporul rapid [40] și traversând segreganții rezultați. Au fost descrise tulpinile mum3 și osw1 [27]. Tulpinile de tip sălbatic (NKY895) și dit1 (AN264) utilizate pentru testele de supraviețuire competitive au fost, de asemenea, descrise în altă parte [20], [41]. Tulpina de S. pombe, YDM124 (h90) a fost furnizată de Dan McCollum (In Mass Worcester).

Tratamente de stres

Testele de fluorescență ale trecerii prin Drosophila

Analize comparative de supraviețuire

O cultură de tip sălbatic sporulat (NKY895) a fost amestecată cu culturi de testare: celule dit1 sporulate (AN264), spori osw1 sau celule de fază staționară (AN117-4B). Toate culturile sporulate au fost> 80% asci. Pentru a determina rația de intrare a tipului sălbatic: celulele tester, amestecurile au fost titrate atât pe mediul de abandonare TRP (selectiv pentru tip sălbatic), cât și ADE (selectiv pentru tulpina testerului). Culturile amestecate au fost peletizate, pete pe agar într-o cutie Petri de 50 mm și muștele au fost introduse așa cum s-a descris mai sus. Pentru a reduce contaminarea, muștele au fost crescute pe mediu steril de suc de mere timp de> 2 zile înainte de experiment. După incubare peste noapte, o lamelă de acoperire a fost îndepărtată de pe capacul cutiei Petri, tăiată în jumătate și agitată în 1 ml de apă într-un tub conic de 15 ml. Diluțiile seriale au fost din nou placate pe medii de abandonare ADE și TRP pentru a determina titrul tulpinilor de tip sălbatic și de testare. Împărțirea punctului final tip sălbatic: raportul tester cu cel din cultura inițială produce calcularea eficienței relative de supraviețuire a sporilor de tip sălbatic prezentată în tabelul 2.

Mulțumiri

Autorii doresc să-i mulțumească lui Dan McCollum (U Mass, Worcester) pentru tulpinile de S. pombe și mulți membri ai Centrului de Drojdie Stony Brook pentru încurajarea lor pe parcursul acestei lucrări.

Contribuțiile autorului

Conceput și proiectat experimentele: MJK AMN. A efectuat experimentele: AEC RKR AMN. Am analizat datele: AMN. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: MJK. Am scris lucrarea: MJK AMN.