Afiliere INCDBNA-IBNA, Institutul Național de Cercetare și Dezvoltare pentru Biologie și Nutriția Animalelor, Balotești, România

subproduse

Afiliere INCDBNA-IBNA, Institutul Național de Cercetare și Dezvoltare pentru Biologie și Nutriția Animalelor, Balotești, România

Afiliere INCDBNA-IBNA, Institutul Național de Cercetare și Dezvoltare pentru Biologie și Nutriția Animalelor, Balotești, România

Afiliere INCDBNA-IBNA, Institutul Național de Cercetare și Dezvoltare pentru Biologie și Nutriția Animalelor, Balotești, România

Afiliere INCDBNA-IBNA, Institutul Național de Cercetare și Dezvoltare pentru Biologie și Nutriția Animalelor, Balotești, România

Afiliere INCDBNA-IBNA, Institutul Național de Cercetare și Dezvoltare pentru Biologie și Nutriția Animalelor, Balotești, România

Afiliere INCDBNA-IBNA, Institutul Național de Cercetare și Dezvoltare pentru Biologie și Nutriția Animalelor, Balotești, România

Afiliere INCDBNA-IBNA, Institutul Național de Cercetare și Dezvoltare pentru Biologie și Nutriția Animalelor, Balotești, România

  • Ionelia Taranu,
  • Mikhail Grass,
  • Gina Cecilia Pistol,
  • Monica Motiu,
  • Daniela E. Marin,
  • Nicoleta Lefter,
  • Mariana Ropota,
  • Mihaela Habeanu

Cifre

Abstract

Torturile cu ulei de Camelina rezultă după extragerea uleiului din planta Camelina sativa. În acest studiu, prăjiturile cu ulei de camelină au fost hrănite la porci de îngrășat timp de 33 de zile, iar efectul acesteia asupra performanței, a analiților biochimici din plasmă, a mediatorilor pro/antiinflamatori și a apărării detoxifiante antioxidante în splină a fost investigat în comparație cu făina de floarea-soarelui. 24 de porci TOPIG încrucișați au fost repartizați aleatoriu la unul dintre cele două tratamente dietetice experimentale care conțin fie 12% făină de floarea-soarelui (tratament 1-T1), fie 12,0% prăjituri cu ulei de camelină, bogate în acizi grași polinesaturați ω-3 (ω-3 PUFA) ( tratamentul 2-T2). Rezultatele nu au arătat niciun efect al dietei T2 (prăjituri cu camelină) asupra consumului de furaje, creșterii medii în greutate sau eficienței furajelor. Consumul de dietă cu camelină a dus la o scădere semnificativă a concentrației plasmatice de glucoză (18,47%), cu o tendință spre o scădere a colesterolului plasmatic. În splină, dieta T2 a modulat răspunsul imun celular prin scăderea expresiei proteinelor și genelor markerilor proinflamatori, interleukina 1-beta (IL-1β), factorul de necroză tumorală alfa (TNF-α), interleukina 6 (IL-6) și interleukina (IL-8) și ciclooxigenaza 2 (COX-2) în comparație cu dieta T1. În schimb, dieta T2 a crescut (P Tabelul 1. Compoziția și conținutul de nutrienți calculat în dietele experimentale (%).

2. Analiza acizilor grași dietetici

Probele de furaje au fost prelevate la începutul experimentului și au fost analizate pentru compoziția acizilor grași. Lipidele au fost extrase prin metanol-hexan (ASRO-SR EN ISO 15304/AC, 2005). Probele au fost analizate folosind un cromatograf de gaze Perkin Elmer (Clarus 500, SUA) echipat cu injector (temperatura 250 ° C), detector de ionizare a flăcării (temperatura 260 ° C) și coloană cromatografică capilară BPX70 pentru esteri metilici ai acizilor grași (60 m × 0,25 mm id × 0,20 µm, Agilent, fluxul coloanei a fost de 50 mL/min, iar raportul de divizare a fost de 1∶100). Programul de temperatură a fost după cum urmează: creșteți de la 180 ° C la 220 ° C la 5 ° C/min și mențineți timp de 7 min, apoi creșteți la 220 ° C la 5 ° C/min și mențineți timp de 10 min. Timpul total de analiză a fost de 29 min. Vârfurile au fost identificate prin compararea timpilor de retenție cu soluția individuală de acizi grași de referință individuală (37 Component FAMWE Mix metilat, SUPELCO, SUA și ulei de soia, SUPELCO, SUA) (Tabelul 2 și Tabelul 3).

3. Măsurarea parametrilor biochimici ai plasmei

Concentrația de glucoză, colesterol total, colesterol lipoproteic de înaltă densitate (colesterol HDL), trigliceride, proteine ​​totale, uree, Ca, Mg, Fe și activitatea fosfatazei alcaline (ALKP), glutamat piruvat transaminază (TGP) și glutamat oxaloacetat transaminază (TGO) au fost determinate pe un analizor automat de chimie BS-130 (Bio-Medical Electronics Co., LTD, China), pe plasma de sânge colectată la sfârșitul experimentului și apoi centrifugate timp de 25 de minute la 3500 × g.

4. Măsurarea subseturilor totale de imunoglobulină plasmatică (IgG, IgA, IgM)

Concentrația totală a subseturilor de imunoglobulină (Ig) (G, A și M) a fost măsurată prin ELISA (Bethyl, Medist, Montgomery, TX, SUA) în plasma sanguină, după diluarea plasmatică, după cum urmează: 1∶4000 (IgA), 1 20120.000 (IgG) și 1∶10.000 (IgM), după cum sa raportat anterior [21], conform instrucțiunilor producătorului. Absorbanta a fost citita la 450 nm folosind un cititor de microplaci (Tecan Sunrise, Austria).

5. Măsurarea capacității antioxidante a splinei

Nivelul de antioxidanți în țesutul splinei porcilor hrăniți cu dietă de floarea-soarelui de control sau cu prăjituri cu ulei de camelină a fost măsurat cu setul de capacitate antioxidantă totală (TAC) (QuantiChrom - BioAssay Systems, SUA). Pe scurt, probele de țesut splenic înghețat (100 mg) au fost întrerupte și omogenizate prin utilizarea omogenizatorului Ultra-Turrax (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germania) și tampon de fosfat conținând IGEPAL 1%, deoxicolat de sodiu 0,5%, SDS 0,1% și complet Tablete de cocktail (fără EDTA) inhibitoare de protează. Omogenatele au fost păstrate timp de 30 de minute pe gheață și apoi centrifugate la 10.000 × g la 4 ° C timp de 10 minute. 20 µL de lizat de țesut splenic sau soluție standard Trolox plus 100 µL de reactiv de lucru au fost adăugați la microplaca cu 96 de godeuri, amestecate prin atingere și incubate la temperatura camerei timp de 10 minute, conform instrucțiunilor producătorului. Absorbția punctului final a fost citită la 570 nm folosind un cititor de microplăci (TECAN, Sunrise, Austria).

6. Măsurarea producției de oxid nitric de splină

Nivelul oxidului nitric (NO) în splina porcilor hrăniți cu dietă de floarea-soarelui de control sau cu uleiuri de camelină a fost măsurat pentru a determina sinteza NO prin testul Griess, așa cum s-a descris anterior [22]. După precipitarea proteinelor, 100 uL de supernatant au fost amestecate cu un volum egal de reactiv Griess (1% sulfanilamidă, 0,1% naftiletilendiamin dihidroclorură și 2,5% acid fosforic) și incubate la 37 ° C timp de 10 minute. Absorbanța nitritului a fost măsurată la 550 nm folosind un cititor de microplăci (TECAN, Sunrise, Austria) și o curbă standard NaNO2 variind de la 0 la 100 (M. Concentrația a fost calculată pe baza intervalului de NaNO2, exprimat ca µmol/L NO2 - .

7. Analiza expresiei genice (qPCR)

7.1 Extragerea ARN-ului total.

Probele de țesut splenic înghețate (100 mg) au fost întrerupte și omogenizate în tampon RTL (QIAGEN GmbH, Germania) folosind omogenizator Ultra-Turrax (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germania). ARN-ul total a fost extras folosind kitul Qiagen RNeasy midi (QIAGEN GmbH, Germania), conform recomandărilor producătorului. După extracție, ARN a fost tratat cu un inhibitor de ribonuclează (RNasin Plus RNase Inhibitor; Promega Corp., SUA) și cantitatea și calitatea ARN-ului total extras au fost măsurate pe un spectrofotometru Nanodrop ND-1000 (Thermo Fischer Scientific, SUA). Integritatea ARN-ului a fost verificată prin electroforeză pe gel de agaroză.

7.2 sinteza ADNc.

După extragerea ARN-ului total din fiecare probă de splină, ADNc a fost generat utilizând setul de transcripție inversă M-MuLV (Fermentas, Thermo Fischer Scientific, SUA) conform protocolului producătorului. Pe scurt, 1 pg de ARN total a fost utilizat ca material de pornire, la care s-au adăugat 0,5 pg de oligo (dT). ARN-urile și oligo (dT) au fost amestecate ușor, apoi centrifugate și incubate la 65 ° C timp de 5 minute, răcite pe gheață, centrifugate și plasate din nou pe gheață. 4 uL de tampon de reacție 5X, 2 uLof dNTP Mix (1 mM fiecare dNTP) și 2 uL de MMuLV Reverse Transcriptase (40 U) au fost adăugate în continuare la amestec. Probele au fost incubate la 42 ° C timp de 60 min și reacția a fost inactivată la 70 ° C timp de 10 min.

7.3 PCR cantitativ în timp real.

8. Detectarea proteinelor citokinice (ELISA)

9. Analize de imunoblotare

10. Analize statistice

Toate datele sunt exprimate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Analiza ANOVA într-un mod a fost efectuată pentru a investiga diferențele statistice dintre grupuri pentru toți parametrii analizați. Alte diferențe între medii au fost determinate prin procedura Fisher a celei mai mici diferențe pătrate. Analiza statistică a datelor a fost efectuată cu software-ul Statview 5.0 (SAS Institute Inc, Cary, NC) și valorile P Tabelul 5. Efectele dietei T1 (făină de floarea-soarelui) sau a dietei T2 (prăjituri cu ulei de camelină) asupra sângelui selectat parametrii biochimici * .

4. Efectul prăjiturilor cu ulei de camelină asupra capacității antioxidante a splinei și sinteza oxidului nitric

A fost evaluat efectul dietei de prăjituri cu ulei de camelină asupra stării antioxidante totale și a producției de NO în splina porcilor. Rezultatele au arătat o creștere semnificativă statistic a TAC-ului total (1060,35 față de 911,55, P = 0,002) și a NO (47,31 față de 28,7, P = 0,053) în splina de porci tratați pentru 33d cu dieta de prăjituri cu ulei de camelină (Figura 1 și Figura 2).

Nivelul de antioxidanți din probele de splină derivate din porci hrăniți cu prăjituri cu ulei de camelină sau martor a fost măsurat ca kit de capacitate antioxidantă (TAC) (QuantiChrom - BioAssay Systems, SUA). Rezultatele sunt exprimate ca capacitate antioxidantă Trolox echivalentă. Datele sunt mijloace ± SEM. Testul ANOVA unidirecțional, urmat de testul Fisher, a fost efectuat pentru a analiza efectul diferitelor tratamente asupra nivelului TEAC (* P Figura 2. Efectul prăjiturilor cu ulei de camelină asupra producției de NO în splină.

Sinteza NO a fost determinată prin măsurarea nivelului de oxid nitric în splina porcilor hrăniți sau nu cu prăjituri cu ulei de camelină utilizând testul Griess. Absorbanța nitritului a fost măsurată la 550 folosind un cititor de microplăci (Tecan Infinite 200Pro, Austria) și o curbă standard NaNO2 variind de la 0 la 100 (M. Concentrațiile au fost calculate pe baza intervalului de NaNO2, exprimat ca umol/L NO2 -. Valorile sunt mijloacele ± SEM, din două replici. Analiza statistică a fost efectuată folosind ANOVA unidirecțional, urmată de testul Fisher (* P Figura 3. Efectul tortelor cu ulei de camelină asupra expresiei citokinelor splinei.

Porcii au primit două tratamente grase dietetice diferite: dieta T1 (ulei de floarea soarelui) și dieta T2 (ulei de camelină). Probele de splină au fost prelevate în ziua 33 a tratamentelor și au fost analizate pentru exprimarea ARNm a citokinei prin RT-PCR cantitativă. Rezultatele sunt exprimate ca modificări ale pliurilor după normalizarea expresiei genei citokinei țintă la media a 2 gene de referință exprimate intern. Valorile sunt mijloacele ± SEM, din două replici. Analiza statistică a fost efectuată utilizând ANOVA unidirecțional, urmată de testul Fisher (* P Figura 4. Efectul tortelor cu ulei de camelină asupra expresiei markerilor inflamatori în splină.

Probele de splină au fost prelevate la sfârșitul studiului în ziua 33 și au fost analizate pentru exprimarea mARN-ului COX-2, iNOS și eNOS prin RT-PCR cantitativă. Rezultatele sunt exprimate ca schimbare de ori după normalizarea expresiei genei țintă la media expresiei a 2 gene de referință internă. Valorile sunt mijloacele ± SEM, din două replici. Analiza statistică a fost efectuată utilizând ANOVA unidirecțional, urmată de testul Fisher (* P Tabelul 7. Concentrațiile de citokine * în plasmă și splină de porci hrăniți cu dietă T1 (făină de floarea-soarelui) sau dietă T2 (prăjituri cu ulei de camelină).

6. Efectele prăjiturilor de ulei de camelină dietetice asupra expresiei genice a moleculelor de semnalizare PPARγ, MAPK-p38α și NF-κB din splină

Expresia genetică a factorilor nucleari PPARγ și NF-κB, MAPK-p38α și moleculele de semnalizare asociate cu sinteza și inflamația citokinelor sunt prezentate în Figura 5. Rezultatele noastre au arătat o creștere semnificativă, de 3,53 ori a PPARγ în splina porcilor de pe uleiul de camelină. dieta torturilor (P Figura 5. Efectul tortelor cu ulei de camelină asupra exprimării moleculelor de semnalizare în splină.

Probele de splină au fost prelevate la sfârșitul studiului în ziua 33 și au fost analizate pentru PPAR-γ, NF-κB, MAPK-p-38α și expresia ARNm Nrf2 prin RT-PCR cantitativă. Rezultatele sunt exprimate ca schimbare după normalizarea expresiei genei țintă la media expresiei a două gene de referință internă. Valorile sunt mijloacele ± SEM, din două replici. Analiza statistică a fost efectuată folosind ANOVA unidirecțional, urmată de testul Fisher (* P Figura 6. Expresia fosfo-MAPK-p38α în lizatul de splină proteică.

Nivelul fosforilării MAP-kinazei p38α în splina porcilor hrăniți sau nu cu prăjituri cu ulei de camelină a fost determinat prin Western blot și exprimat ca raportul dintre intensitățile benzii fosfo-MAPK-p38α și respectiv β-actină. Pentru fiecare grup de animale, valorile medii ± SEM au fost calculate și prezentate ca histogramă. Analiza statistică a fost efectuată utilizând ANOVA unidirecțional, urmată de testul Fisher (* P Figura 7. Expresia fosfo-p65 NF-κB în lizatul de splină proteică.

Nivelul de fosforilare p65-NF-kB la splina de porci hrăniți sau nu cu prăjituri cu ulei de camelină a fost determinat prin western blot și exprimat ca raportul dintre intensitățile benzii fosfo-p65 NF-κB și respectiv β-actină. Pentru fiecare grup de animale, valorile medii ± SEM au fost calculate și prezentate ca histogramă. Analiza statistică a fost efectuată folosind ANOVA unidirecțional, urmată de testul Fisher (* P Figura 8. Efectul tortelor cu ulei de camelină asupra expresiei enzimelor antioxidante.

Probele de splină au fost prelevate la sfârșitul studiului în ziua 33 și au fost analizate pentru exprimarea ARNm SOD, CAT și GPx prin RT-PCR cantitativă. Rezultatele sunt exprimate ca schimbare de ori după normalizarea expresiei genei țintă la media expresiei a 2 gene de referință internă. Valorile sunt mijloacele ± SEM, din două replici. Analiza statistică a fost efectuată utilizând ANOVA unidirecțional, urmată de testul Fisher (* P 2 = -0,72, TNF-α: R2 = -0,55 și IL-1β: R2 = -0,65) și, de asemenea, între PPAR-γ și genă codificare pentru COX-2 (R 2 = −0,64). PPAR-γ a fost puternic corelat pozitiv cu expresia enzimelor antioxidante (GPx: R2 = 076, SOD: R2 = 0,71 și CAT: R2 = 0,85). Așa cum era de așteptat, NF-κB și MAPK-p38α au fost corelate negativ cu PPAR-γ și corelate pozitiv cu expresia markerului pro-inflamator (TNF-α: R 2 = 0,55; IL-8: R 2 = 0,51). De asemenea, s-au găsit corelații negative între enzimele antioxidante și markerii proinflamatori (Figura 9).

Procedeul coeficientului de corelație Pearson a fost utilizat pentru a stabili relații între expresia genică a receptorilor nucleari PPARγ, NF-κB și semnalizarea p38-MAPK, molecule legate de inflamație și enzime de apărare antioxidante în splina porcilor primiți prăjituri dietetice cu camelină. Gradientul de culoare roșu și verde de la întuneric la lumină arată gradul de corelații pozitive sau negative la splina de porci tratați sau nu cu dietă camelină.