Ming-Che Shen

1 Departamentul de patologie, Universitatea din Alabama la Birmingham, Birmingham, Alabama, Statele Unite ale Americii,

stearic

Xiangmin Zhao

1 Departamentul de patologie, Universitatea din Alabama la Birmingham, Birmingham, Alabama, Statele Unite ale Americii,

Gene P. Siegal

1 Departamentul de patologie, Universitatea din Alabama la Birmingham, Birmingham, Alabama, Statele Unite ale Americii,

2 departamente de biologie și chirurgie celulară, de dezvoltare și integrativă, Universitatea Alabama din Birmingham, Birmingham, Alabama, Statele Unite ale Americii,

3 Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Preventivă, Universitatea din Alabama la Birmingham, Birmingham, Alabama, Statele Unite ale Americii,

Renee Desmond

3 Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Preventivă, Universitatea din Alabama la Birmingham, Birmingham, Alabama, Statele Unite ale Americii,

Robert W. Hardy

1 Departamentul de patologie, Universitatea din Alabama la Birmingham, Birmingham, Alabama, Statele Unite ale Americii,

3 Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Preventivă, Universitatea din Alabama la Birmingham, Birmingham, Alabama, Statele Unite ale Americii,

Conceput și proiectat experimentele: RH XZ GS. A efectuat experimentele: M-CS XZ. Am analizat datele: RH XZ GS RD. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: RD. Am scris lucrarea: XZ RH GS.

Date asociate

Abstract

Introducere

Materiale și metode

Toate procedurile in vivo pentru animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC), Universitatea din Alabama la Birmingham (UAB).

Reactivi

Acidul stearic (≥98,5%), acidul oleic (≥99%), acidul linoleic (≥99%), pământul diatomeu, insulina, dexametazona, 3-izobutil-1-metil-xantina și albumina serică bovină fără acid gras obținut de la Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO). Albastrul Trypan a fost achiziționat de la Eastman Kodak Company (Rochester, NY). Oil Red O a fost obținut de la Rowley Biochemical (Rowley, MA) și Hematoxylin I a fost obținut de la Richard-Allan Scientific (Kalamazoo, MI).

Animale și diete

Deoarece studiile noastre anterioare au folosit șoareci nudiți atimici și acești șoareci sunt utilizați în mod obișnuit pentru experimentele cu xenogrefă folosind celule canceroase umane, am folosit aceiași șoareci pentru a ne confirma ipoteza. Șoareci athimici femele în vârstă de trei până la patru săptămâni au fost achiziționați de la Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, IN) și au fost menținute în cuști microizolatoare în instalații fără patogeni. Animalele au fost împărțite aleatoriu în patru grupuri de câte 10 șoareci fiecare și au fost plasate pe una din cele patru diete: o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (5% dietă cu ulei de porumb) comparabilă cu cea a rozătoarelor normale, o dietă cu 20% ulei de șofrănel, un 17% ulei de porumb/3% dietă cu ulei de șofrănel și o dietă cu 17% acid stearic/3% dietă cu ulei de șofrănel. Dieta bogată în acid stearic utilizată în aceste studii conținea o cantitate minimă de acizi grași esențiali necesari pentru creșterea și dezvoltarea normală, iar acidul stearic din dietă ca acid gras primar. Această dietă minimizează efectele confuzive ale altor acizi grași, fără a afecta greutatea corporală totală [13], [14]. Aceste diete au fost pregătite de Harlan-Teklad (Madison, WI) și au fost publicate detalii [13].

Animalele au fost hrănite ad libitum timp de 18 săptămâni și 3 zile, iar cantitatea de alimente consumate a fost înregistrată. Șoarecii au fost anesteziați cu 3% izofluran în 2,5% O2 și au fost cântăriți săptămânal. La 18 săptămâni și 3 zile șoarecii au fost sacrificați și creierul, inima, plămânii, rinichii, ficatul și grăsimea abdominală au fost colectate.

Absorptiometrie cu raze X cu energie duală (DXA)

Șoarecii au fost scanați folosind absorptiometrul cu raze X cu energie X Lunar PIXImus (Fitchburg, WI) utilizând versiunea software 1.45 după 18 săptămâni în dietele lor respective (1 zi pentru DXA). Folosind o procedură aprobată de IACUC, fiecare animal a fost plasat într-un recipient etanș și anesteziat folosind metoda microdrop cu Isofluran (4%). Odată ce șoarecele a fost imobil și respira constant, a fost plasat într-o poziție prosternată pe placa de imagistică DXA și scanat. În timpul scanării șoarecele a rămas anesteziat folosind un amestec de izofluran (3%) și oxigen (500 ml/min). Fiecare scanare a durat mai puțin de 5 minute. Datele obținute din aceste scanări au inclus conținutul mineral osos (BMC), densitatea minerală osoasă (BMD), masa slabă și masa grasă.

Rezonanță magnetică cantitativă (QMR)

Compoziția corporală in vivo (grăsime corporală totală și țesut slab) a șoarecilor a fost, de asemenea, determinată în ziua următoare DXA utilizând un analizor de compoziție EchoMRI 3-în-1 cu rezonanță magnetică cantitativă (QMR) (Echo Medical Systems, Houston, TX). Fiecare animal a fost plasat într-un tub transparent care a restricționat mișcarea verticală, dar a permis un flux constant de aer. Nu a fost necesară anestezie. Tubul a fost introdus în instrument și a fost inițiată scanarea.

Măsurarea glucozei serice, insulinei, leptinei, proteinei chemotactice monocite-1 (MCP-1), interleukinei-6 (IL-6) și adiponectinei

Datorită cantității limitate de ser disponibil de la șoareci, am selectat 6 analiți care ar aborda cele mai probabile două mecanisme (rezistența la insulină și citokinele inflamatorii crescute). Am analizat IL-6 și MCP-1 (markeri asociați în general cu inflamația) în serul șoarecelui folosind kituri ultra-sensibile de testare a citokinelor de șoareci Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD). Coeficientul de variație (CV) pentru aceste teste a fost de 9%, respectiv 3%. Leptina serică a șoarecelui (asociată cu obezitatea, apetitul și angiogeneza), insulina și adiponectina (asociată cu o sensibilitate îmbunătățită la insulină) au fost măsurate folosind kituri de radioimunologie Millipore (Billerica, MA) cu CV-uri de 7%, 4% și respectiv 2% . Glucoza serică a fost măsurată printr-un test de glucoză oxidază efectuat pe un instrument Stanbio Sirrus (Laboratorul Stanbio, Boerne, TX). Acest test a avut un CV de 3%.

Secțiunea parafinei și colorarea H&E

Secțiunile de parafină au fost preparate așa cum s-a descris anterior [15]. Pe scurt, 10% probe de formalină filtrate și tamponate (grăsime abdominală, rinichi și ficat) au fost prelucrate cu un procesor de țesut VIP 1000 (Sakura-Finetek, Torrance, CA) prin alcooli clasificați și xilen, apoi încorporate în blocuri de parafină. Cinci secțiuni de microni au fost tăiate pe un microtom rotativ Leica 2135 (Leica Microsystems, Bannockburn, IL), uscate la aer, deparafinizate și colorate cu pete de hematoxilină și eozină (Richard Allen Scientific, Kalamazoo, MI).

Cultura celulară 3T3L1

Preadipocitele de șoarece 3T3L1, celulele fibroblaste (American Type Culture Collection (ATCC), CL-173) au fost menținute în conformitate cu protocolul recomandat de ATCC, în Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) conținând 10% ser fetal bovin și antibiotice (mediu M1). Diferențierea la adipocite a fost efectuată în conformitate cu procedurile standard [29]. Pe scurt, fibroblastele 3T3L1 au fost însămânțate la 30% confluență și crescute la> 90% confluență. După atingerea confluenței> 90%, mediul M1 a fost înlocuit cu mediu M1 conținut de insulină (5 pg/ml), dexametazonă (0,25 pM) și 3-izobutil-1-metil-xantină (0,5 mM). Două zile mai târziu, celulele au fost schimbate în mediu M1 cu insulină (5 ug/ml) pentru încă 2 zile. Celulele au fost apoi menținute în mediu M1 fără aditivi pentru ultimele 2 zile.

Acizi grași

Acidul stearic, acidul oleic sau acidul linoleic au fost încărcați pe BSA fără acizi grași conform metodei raportate de Spector și Hoak [19]. Pe scurt acid stearic (0,5 g) a fost dizolvat în cloroform (100 ml), amestecat bine cu 10 g pământ de diatomee într-un balon de 1 litru. Amestecul a fost agitat și uscat sub azot până la pulbere. BSA fără acizi grași (1 g) a fost dizolvat în 100 mL DMEM fără fenol roșu, amestecat cu 3 g de amestec acid stearic/pământ diatomeu și agitat timp de 30 de minute. Soluția de acid stearic/BSA a fost filtrată printr-un filtru de 0,45 pm și ajustată la pH 7,4. Concentrația de acid stearic în soluție a fost detectată prin utilizarea unui kit C NEFA (acizi grași neesterificați) (Wako Chemicals, Richmond, VA). Raportul molar final dintre acidul stearic și BSA a fost de 5 la 1, ceea ce este în concordanță cu studiile care indică 7 situsuri totale de legare a acidului gras pe albumină, dintre care 5 sunt considerați candidați cu situs de legare cu afinitate mare [20]. Acidul oleic și linoleic au fost încărcate în același mod. Toate datele experimentale privind celulele 3T3L1 au fost confirmate folosind soluții de control BSA fără acizi grași care au fost supuse aceleiași proceduri pregătitoare descrise, cu excepția faptului că nu s-a adăugat acid gras (martori).

Analiza citometriei de flux

După tratament, celulele 3T3L1 au fost recoltate, spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat rece (PBS) și apoi resuspendate în 100 uL tampon de legare a anexinei (50 mM HEPES, 700 mM NaCl, 12,5 mM CaCl2, pH 7,4). S-a determinat densitatea celulară și celulele au fost diluate la 106 celule/ml. Apoi s-au adăugat 5 uL de Alex Fluo 488 anexină V și 1 uL iodură de propidiu (PI). Celulele au fost ușor oscilate și incubate timp de 15 minute la temperatura camerei. După adăugarea a 400 uL de tampon de legare la fiecare tub, celulele au fost ținute pe gheață și analizate prin citometrie de flux în decurs de 1 oră. Celulele care au colorat pozitiv pentru Alex Fluo 488 anexina V și negative pentru PI au fost considerate apoptotice. Celulele care au colorat pozitiv atât pentru anexina V cât și pentru PI Fluo 488 au fost luate în considerare fie în stadiul final al apoptozei (moarte celulară programată), fie necrotice. Celulele care au colorat negativ atât pentru anexina V cât și pentru PI Fluo 488 au fost considerate viabile și nu au fost supuse apoptozei măsurabile. Un citometru de flux BD LSR II de la Becton Dickinson a fost utilizat în toate experimentele de flux și datele au fost analizate cu software-ul BD FACS Diva ™ V.6.1.3.

Reacție în lanț a polimerazei cu transcripție inversă (RT-PCR)

Celulele 3T3L1 au fost tratate cu acid stearic 50 uM, acid oleic, acid linoleic sau vehicul timp de 48 de ore. ARN-ul total a fost extras și purificat cu reactiv TRIZOLE (GIBCO Invitrogen, Carlsbad, CA). Prima sinteză a ADNc a ADN-ului a fost realizată folosind kitul de sinteză ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA). Testul PCR a fost efectuat într-un volum de 50 pl, conținând șablon de 4 pl ADN, 45 pl Platinum PCR Supermix (Invitrogen) și 0,2 uM fiecare primer specific. PCR a fost început cu pre-denaturare de 3 min, la 95 ° C și 30 de cicluri de denaturare (95 ° C, 30 s), recușire (52 ° C, 30 s) și 1 min de extensie (72 ° C). Produsele PCR (20 pl) au fost analizate cu ajutorul agarozei 1% în electroforeză pe gel de acid tris-acetat etilendiaminetetraacetic și vizualizate prin colorare cu bromură de etidiu sub ultraviolete; imaginile digitale au fost analizate cu ajutorul unui sistem medical Fuji (FUJIFILM) și a benzilor cuantificate prin software-ul Cantity (FUJIFILM). Rezultatul calculat reprezintă nivelurile relative de expresie ale genelor țintă comparativ cu expresia acestuia într-un grup de vehicule după ce valoarea genelor țintă a fost normalizată la niveluri de expresie gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază (GAPDH).

Secvențele primerului de șoareci înainte și invers utilizate au fost după cum urmează: cIAP2 (sens 5'-CGG GAA ATT GAC CCT GCG-3 '; antisens 5'-GTG CGC ACT GTG CCC TTG-3'), BAX (sens 5 ' ) -CGG CGA ATT GGA GAT GAA CTG-3 ′; antisens 5′-GCA AAG TAG AAG AGG GCA ACC-3 ′), Bcl2 (sens 5′-TAC CGT CGT GAC TTC GCA GAG-3 ′; antisens 5′- GGC AGG CTG AGC AGG GTC TT-3 ′) și GAPDH (sens 5′- CCA TCA CTG CCA CTC AGA AGA C-3 ′; antisens 5′-TAC CCT GAG CCA TGT AGG-3 ′). Toate perechile de primeri au fost sintetizate de Invitrogen (CA).

Test de citotoxicitate

Eliberarea lactatului dehidrogenază (LD) a fost măsurată utilizând un kit de detectare a citotoxicității, conform protocolului producătorului (Roche Molecular Biological Co., Indianapolis, IN). După ce celulele 3T3L1 au fost tratate, 1 ml mediu de cultură celulară a fost îndepărtat, centrifugat la 1.000 g timp de 5 minute și supernatantul a fost testat. Eliberarea de fond numai din mediul de cultură a fost scăzută înainte de raportare.

Colorare cu albastru trypan

După tratament, celulele 3T3L1 au fost recoltate și colorate cu soluție de albastru tripan 0,4%. Celulele din cele patru colțuri ale rețelei (~ 1200 celule) au fost numărate sub un microscop binocular convențional cu câmp luminos. A fost calculat și analizat raportul dintre numărul de celule colorate în albastru și numărul total de celule.

Ulei de roșu O colorare

Lipidele celulare au fost colorate cu roșu ulei O. Pe scurt, un număr identic de celule 3T3L1 au fost plasate în plăci cu 6 godeuri, cultivate și convertite în adipocite așa cum s-a descris mai sus. Celulele au fost apoi fixate cu paraformaldehidă 4% timp de 30 minute și colorate cu o soluție de lucru de roșu ulei O timp de 5 minute. Nucleul celular a fost contracolorat cu hematoxilină și 200 de celule au fost numărate la microscop pentru fiecare probă. Procentul de adipocite convertite a fost apoi calculat. Pentru măsurarea OD, celulele au fost colorate cu roșu ulei O, roșu ulei O a fost apoi eluat cu 1 ml de izopropanol 100% și OD a fost măsurat la 520 nm cu un cititor de microplăci multi-mod Biotek Synergy 2 (BioTek Instruments, Winooski, VT).

Analiza activității Caspase-3

Activitatea Caspase-3 a fost măsurată folosind EnzCheck Capase-3 Activity Kit # 1 conform instrucțiunilor producătorului (Invitrogen, Carlsbad, CA). Pe scurt, celulele 3T3L1 dintr-o placă cu 6 godeuri au fost spălate, recoltate și resuspendate în 50 μl tampon de liză celulară (10 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,2% TRITON X-100) și incubate pe gheață timp de 30 min. Lisatul a fost apoi centrifugat la 5000 rpm timp de 5 minute și 50 ofl de supernatant au fost transferate în godeuri individuale de microplacă. La fiecare probă, s-au adăugat 50 pl de substrat. După incubare timp de 30 de minute la temperatura camerei, fluorescența a fost măsurată cu un cititor de microplăci multi-mode Biotek Synergy 2 (BioTek Instruments, Winooski, VT), excitație/emisie, 341/441. Rezultatele au fost cantitative utilizând o curbă standard generată pentru aceste experimente.