Darlene E. Berryman

transgenici

E148 Grover Center, Școala de Științe Aplicate a Sănătății și Wellness

Colegiul de Științe și Profesii ale Sănătății, Universitatea Ohio

Atena, OH 45701 (SUA)

Articole similare pentru „”

  • Facebook
  • Stare de nervozitate
  • LinkedIn
  • E-mail

Abstract

Introducere

Oamenii în vârstă suferă o redistribuire distinctă a grăsimii caracterizată printr-o scădere a țesutului adipos subcutanat (SAT) și o creștere a țesutului adipos visceral (TVA) [1,2,3]. SAT se găsește sub piele, mai ales în picioare, spate și peretele abdominal anterior și este specializat în depozitarea pe termen lung a acizilor grași liberi și a trigliceridelor, în timp ce TVA înconjoară viscerele abdominale și este mai activă din punct de vedere metabolic și lipolitic decât SAT [3]., 4]. Important, masa TVA este puternic asociată cu multe rezultate metabolice negative observate în obezitate, cum ar fi afectarea metabolismului glucozei și lipidelor [3,4,5,6]. Astfel, se consideră că redistribuirea lipidelor legate de vârstă contribuie la dezvoltarea bolilor metabolice asociate îmbătrânirii, inclusiv diabetul, bolile cardiovasculare, sindromul metabolic și cancerul [3,4,5,6].

Șoarecii antagoniști ai receptorilor GH (GHA) sunt unici prin faptul că, spre deosebire de alte tulpini de șoarece rezistente la GH/deficiente, nu prezintă longevitate extinsă [22]. Șoarecii GHA exprimă o GHA care concurează cu GH endogen pentru legarea la GHR, rezultând reduceri ale nivelurilor IGF-1 la aproximativ 25% din cele ale martorilor și un fenotip pitic [22,23,24]. Șoarecii GHA prezintă diferențe importante dependente de vârstă și sex în ceea ce privește compoziția corpului și homeostazia glucozei în comparație cu alte tulpini pitice de șoareci, și anume șoarecii cu perturbare a genei GHR (GHR -/-) [25,26]. Prin urmare, scopul studiului actual a fost extinderea raportului lui Stout și colab. [7] examinând senescența celulară WAT la șoarecii GHA, o tulpină de șoarece cu acțiune GH/IGF-1 scăzută, dar fără îmbunătățire a duratei de viață. Pe baza faptului că șoarecii GHA au acțiune GH redusă și că șoarecii GHA au capacitate sporită de a stoca grăsimea în depozitele subcutanate odată cu vârsta [26], am emis inițial ipoteza că acești șoareci ar prezenta senescență celulară WAT scăzută, dar nu în aceeași măsură șoareci cu reduceri mai dramatice ale semnalizării GH.

Materiale și metode

Animale

Toate procedurile pentru animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Ohio. Toți șoarecii au fost găzduiți în instalația de la Edison Biotechnology Institute, unde au fost ținuți pe un ciclu de întuneric de 14 ore de lumină/10 ore și au avut acces ad libitum la apă și chow normal (Prolab RMH 3000, care conține 14% din energie din grăsimi, 60% din carbohidrați și 26% din proteine). Dezvoltarea și reproducerea șoarecilor transgenici GHA a fost descrisă anterior [22,24]. Două cohorte de șoareci GHA și de tip sălbatic (WT) au fost utilizate în acest studiu. Un grup de șoareci femele de 18 luni WT și GHA (n = 6 pentru fiecare grup) a fost utilizat pentru colorarea senescenței și PCR în timp real. O cohortă separată de șoareci femele WT și GHA de 18 luni (GHA n = 12, WT n = 13) a fost utilizată pentru toate celelalte teste.

Greutățile țesuturilor

Toți șoarecii au fost eutanasiați cu CO2 și țesuturile au fost imediat excizate și cântărite. Pentru studiile de senescență, au fost colectate cinci depozite WAT, inclusiv subcutanat inghinal (Ing), subscapular (Scap), paraovarian (Para), retroperitoneal (Retro) și mezenteric (Mes). Pentru șoarecii utilizați pentru compoziția corpului și studii de homeostazie a glucozei, au fost colectate patru depozite (Ing, Para, Retro, Mes), precum și alte țesuturi selectate (depozit de țesut adipos maro interscapular, inimă, splină, rinichi, ficat și mușchi gastrocnemius) pentru analize viitoare. Toate țesuturile au fost congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80 ° C. Depozitele Ing, Scap și Retro sunt considerate depozite extraperitoneale, în timp ce depozitele Para și Mes sunt considerate intraperitoneale. Rapoartele WAT extra-/intraperitoneale au fost calculate prin împărțirea sumei ponderilor depozitelor Ing și Retro la suma ponderilor Para și Mes. Din păcate, depozitul Scap nu a fost inclus în acest calcul, deoarece nu a fost cântărit pentru toți șoarecii.

Greutatea corporală și compoziția corpului

Măsurătorile greutății corporale și ale compoziției corporale au fost efectuate cu 1 săptămână înainte de disecție. Măsurătorile compoziției corpului s-au făcut pe șoareci neanesteziați utilizând un analizor de rezonanță magnetică nucleară de masă Minispec mq (Bruker Instruments, Billerica, Mass., SUA) așa cum s-a descris anterior [25].

Măsurarea glicemiei în repaus alimentar

Sângele a fost colectat din tipul de coadă după un post de 12 ore. Nivelurile de glicemie în jeun au fost determinate folosind prima picătură de sânge colectată din vârful cozii. Un glucometru LifeScan OneTouch și benzi de test OneTouch Ultra (LifeScan, Inc., Milpitas, California, SUA) au fost utilizate pentru măsurarea glicemiei.

Teste de toleranță la glucoză și insulină

Testele de toleranță la glucoză au fost efectuate cu 2 săptămâni înainte de disecție. Șoarecii au fost posti timp de 12 ore înainte de măsurători. S-au administrat injecții intraperitoneale de 0,01 ml glucoză 10% în soluție salină sterilă tamponată cu fosfat per gram de greutate corporală. Măsurătorile de glucoză au fost efectuate folosind un glucometru LifeScan OneTouch și benzi de testare OneTouch Ultra (LifeScan, Inc.) înainte de injectarea glucozei și la 15, 30, 45, 60, 90, 120 și 150 de minute după injectare. Testele de toleranță la insulină au fost efectuate cu 1 săptămână înainte de disecție. S-au administrat injecții intraperitoneale de 0,01 ml de 0,075 U/ml insulină (Humulin®; Eli Lilly și Company) pe gram de greutate corporală. Măsurătorile glicemiei utilizând un glucometru LifeScan OneTouch și benzi de testare (LifeScan, Inc.) au fost efectuate înainte de injectarea insulinei și la 15, 30, 45, 60, 90 și 120 de minute după injectare. Șoarecii nu au fost posti înainte de testele de toleranță la insulină, dar li sa refuzat accesul la alimente în timpul testelor.

Colorarea β-galactozidazei asociată cu senescența

Pentru a determina acumularea de celule senescente, țesutul adipos disecat a fost colorat pentru activitatea SA-β-gal imediat după disecție, așa cum s-a descris anterior [7]. Pe scurt, țesutul adipos a fost fixat timp de 10 min în 10% formaldehidă cu 1% glutaraldehidă, incubat peste noapte la 37 ° C într-o soluție de colorare conținând X-galactoză (1 mg/ml X-gal, 40 m M acid citric/Na fosfat tampon, pH 6,0), apoi clătite și depozitate în soluție salină tamponată cu fosfat la 4 ° C. Procentele de celule SA-β-gal-pozitive au fost determinate prin compararea fazelor și a imaginilor DAPI din patru câmpuri diferite ale fiecărei probe.

PCR în timp real

Țesutul adipos de la șoareci femele de 18 luni GHA și WT a fost congelat rapid la momentul disecției și depozitat la -80 ° C. Extracția ARN a fost efectuată utilizând reactiv TRIzol, în conformitate cu protocolul producătorului (Fisher Scientific). ADNc a fost sintetizat folosind truse de sinteză ADNc Maxima First Strand și s-a efectuat PCR cantitativ în timp real folosind Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix (Thermo Scientific) cu un Bio-Rad iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, California, SUA). Exemplele de secvențe utilizate pentru IL-6 au fost 3′-TCC GGC ACC AAC AGT GGT CG-5 ′ înainte și 3′-CCT TTA CTC TTT TCT CAA CAC GT-5 ′ invers și pentru primeri p16 3′-CGC TCT GGC TTT CGT GAA C-5 ′ înainte și 3 ′-TTG CCC ATC ATC ATC ACC TGG-5 ′ invers. Nivelurile de expresie au fost normalizate la nivelul genelor de menaj beta 2 microglobulină (B2m) și proteina ribozomală S3 (Rps3). Pentru Rps3, secvențele de exemplu au fost 3'-ATC AGA GAG TTG ACC GCA GTT-5 ′ înainte și 3′-AAT GAA CCG AAG CAC ACC ATA-5 ′ inversă. Pentru B2m, secvențele de exemplu au fost 3'-CTG GTC TTT CTA TAT CCT GGC T-5 ′ înainte și 3′-CAT GTC TCG ATC CCA GTA GAC-5 ′ inversă. Analiza datelor qPCR a fost efectuată cu software-ul Biogazelle qbasePLUS.

Analize statistice

Comparațiile au fost făcute fie utilizând testul t nepereche Student, fie, în cazul în care au fost făcute comparații multiple, prin ANOVA bidirecțională urmată de testele post-hoc LSD ale lui Fisher. Toate analizele statistice au fost efectuate utilizând SPSS versiunea 17.0.

Rezultate

Lungimea corpului, compoziția corpului, greutățile depozitului și raportul WAT extra-/intraperitoneal

Așa cum era de așteptat, șoarecii GHA de 18 luni aveau o lungime a corpului semnificativ mai mică (GHA 87,3 ± 0,6 cm față de WT 100,6 ± 0,7 cm, p 0,05). Datele sunt exprimate ca medie ± SEM.

FIG. 4

Expresia genetică a markerilor senescenți la șoareci GHA (n = 6) și WT (n = 6) de 18 luni. A Comparația expresiei p16. b Comparația expresiei IL-6. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM. Scrisoarea cu indicativ se referă la media depozitului. Mijloacele care indică o literă cu indicativ comun nu sunt semnificativ diferite (p> 0,05). BAT = țesut adipos maro interscapular; n.s. = nicio diferență semnificativă.

Discuţie

Majoritatea studiilor anterioare care au examinat impactul genotipului GHA asupra dimensiunii și compoziției corpului s-au concentrat asupra șoarecilor masculi. Aceste studii arată că șoarecii masculi GHA au o greutate corporală redusă la vârste mici, dar până la vârsta de aproximativ 11 luni nu mai diferă de controalele greutății corporale totale datorită creșterilor extraordinare în masa grasă [22,25,26]. Au fost publicate mai puține studii care examinează șoarecii GHA femele. Un studiu anterior care a evaluat longitudinal modificările greutății corporale la șoarecii GHA de sex feminin a arătat că, spre deosebire de șoarecii masculi GHA, femelele păstrează greutăți corporale semnificativ mai mici decât martorii colegilor de gunoi cel puțin până la vârsta de 84 săptămâni [26]. În plus, șoarecii GHA din acest studiu au scăzut lungimea corpului, ceea ce este în concordanță cu rapoartele anterioare că șoarecii GHA sunt pitici în comparație cu șoarecii WT [22,24]. În ceea ce privește compoziția corpului, șoarecii GHA masculi și femele s-au dovedit a avea un procent crescut de grăsime corporală și un procent scăzut de grăsime slabă de-a lungul vieții, deși bărbații prezintă creșteri mai mari ale adipozității pe măsură ce îmbătrânesc decât femelele [22,26]. Datele noastre despre șoareci GHA de 18 luni au arătat o reducere cu 22% a greutății corporale totale, o reducere cu 33% a masei slabe și o creștere cu 10% a procentului de grăsime corporală, în conformitate cu rapoartele anterioare.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de programul Eminent Scholar al statului Ohio, care include un cadou de la Milton și Lawrence Goll (JJK), grantul Institutelor Naționale de Sănătate AG031736 (JJK, DEB, EOL), Institutul de Diabet de la Universitatea Ohio (DEB, RC, LAH, ERL) și veteranii americani (JJK, ERL). Aceste surse de finanțare nu au avut nici o implicare în proiectarea studiului, colectarea datelor, interpretarea datelor, redactarea raportului sau decizia de a publica această lucrare.

Declarație de divulgare

Autorii nu raportează niciun conflict de interese.