Afilieri Departamentul de Medicină Internă - Geriatrics Research, Southern Illinois University School of Medicine, Springfield, Illinois, Statele Unite ale Americii, Departamentul de farmacologie și fiziologie, Southern Illinois University School of Medicine, Springfield, Illinois, Statele Unite ale Americii

perturbarea

Afiliere Institutul de chimie și fizico-chimie a biologiei (IQUIFIB), Facultatea de Farmacie și Biochimie, Universitatea din Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina

Departamentul de afiliere pentru medicină internă - Cercetare geriatrie, Școala de Medicină a Universității Southern Illinois, Springfield, Illinois, Statele Unite ale Americii

Afilieri Departamentul de Medicină Internă - Cercetare Geriatrică, Southern Illinois University School of Medicine, Springfield, Illinois, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Morfologie, Laboratorul de Biologie Celulară, Institutul de Științe Biologice, Universitatea Federală din Minas Gerais, Belo Horizonte, Brazilia

Afilieri Departamentul de Medicină Internă - Cercetare Geriatrică, Universitatea Southern Illinois Școala de Medicină, Springfield, Illinois, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Fiziologie, Colegiul de Medicină, Universitatea King Saud, Riyadh, Arabia Saudită

Departamentul de afiliere pentru medicină internă - Cercetare geriatrie, Școala de Medicină a Universității Southern Illinois, Springfield, Illinois, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru medicină internă - Cercetare geriatrie, Școala de Medicină a Universității Southern Illinois, Springfield, Illinois, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru medicină internă - Cercetare geriatrie, Școala de Medicină a Universității Southern Illinois, Springfield, Illinois, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru medicină internă - Cercetare geriatrică, Școala de Medicină a Universității Southern Illinois, Springfield, Illinois, SUA

Departamentul de afiliere pentru științe biomedicale, Institutul de biotehnologie Edison, Universitatea Ohio, Atena, Ohio, Statele Unite ale Americii

Afilieri Departamentul de Medicină Internă - Geriatrics Research, Southern Illinois University School of Medicine, Springfield, Illinois, Statele Unite ale Americii, Departamentul de farmacologie și fiziologie, Southern Illinois University School of Medicine, Springfield, Illinois, Statele Unite ale Americii

  • Michael S. Bonkowski,
  • Fernando P. Dominici,
  • Oge Arum,
  • Juliana S. Rocha,
  • Khalid A. Al Regaiey,
  • Reyhan Westbrook,
  • Adam Spong,
  • Jacob Panici,
  • Michal M. Masternak,
  • John J. Kopchick

Cifre

Abstract

Citare: Bonkowski MS, Dominici FP, Arum O, Rocha JS, Al Regaiey KA, Westbrook R, și colab. (2009) Întreruperea receptorului hormonului de creștere împiedică restricționarea caloriilor de la îmbunătățirea acțiunii insulinei și a longevității. PLOS ONE 4 (2): e4567. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004567

Editor: Kathrin Maedler, Universitatea din Bremen, Germania

Primit: 8 septembrie 2008; Admis: 9 decembrie 2008; Publicat: 23 februarie 2009

Finanțarea: Acest proiect a fost susținut de NIA, AG 19899 și u19 AG023122, de către Ellison Medical Foundation și de SIU Geriatrics Medicine Initiative. JJK este susținut în parte de programul Eminent Scholars al statului Ohio, care include un cadou de la Milton și Lawrence Goll și de AG19899-05. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Marea majoritate a mutațiilor care întârzie îmbătrânirea și prelungesc durata de viață a șoarecelui (Mus musculus) sunt fie direct, fie indirect, modifică semnalizarea somatotropă și/sau de insulină [1], [2]. Există o diafragmă intra- și extracelulară considerabilă între hormonul de creștere (GH), factorul de creștere asemănător insulinei 1 (IGF-1) și insulina în medierea creșterii și a metabolismului la mamifere [3]. Aceste căi de semnalizare sunt extrem de conservate în filă; iar mutațiile care afectează semnalizarea omologă IGF-1/insulină și expresia genei în aval cresc longevitatea la drojdie (Saccharomyces cerevisiae), viermi (Caenorhabditis elegans) și muște (Drosophila melanogaster) [4], [5]. Luate împreună, constatările menționate mai sus afirmă semnalizarea GH/IGF-1/insulină (și omologă) ca unul dintre mediatorii cheie ai longevității.

Restricția calorică (CR) este singurul tratament de mediu cunoscut care crește în mod constant durata medie și maximă de viață și întârzie îmbătrânirea în organisme, de la drojdie la mamifere [6], [7]. În plus față de longevitatea prelungită și incidența redusă a cancerului, cele mai consistente răspunsuri la RC la mamifere includ reduceri ale insulinei periferice (adică din sânge), GH, IGF-1 și niveluri de glucoză [6], [8]. Acești biomarkeri ai unui „răspuns CR” au fost raportați la specii variind de la șoareci la oameni [4]. Interesant, există o suprapunere fenotipică considerabilă între șoarecii de pe CR și mulți șoareci mutanți de lungă durată. Aceste similitudini includ reduceri ale greutății corporale, mărimii corpului, incidenței bolilor neoplazice, GH/IGF1 periferic, insulină și glucoză, în raport cu controalele respective [9] - [11]. În plus, majoritatea șoarecilor mutanți de lungă durată și șoarecilor cu CR pe termen lung prezintă îmbunătățiri ale sensibilității la insulină, eficienței hranei și a sănătății. Aceste similitudini sugerează că studierea interacțiunilor dintre mutațiile care extind viața și CR poate dezvălui ce căi și mecanisme sunt utilizate de CR pentru a modifica îmbătrânirea.

Raportăm aici două studii pe termen lung, despre interacțiunea dintre perturbarea GHR și CR la șoareci masculi care au fost concepute pentru a răspunde următoarelor întrebări: 1) Mutația GHRKO modulează sau ablează complet beneficiile CR pe durata vieții? 2) Cum îmbunătățește CR sensibilitatea și longevitatea la insulină la șoarecii normali? 3) De ce CR nu reușește să îmbunătățească sensibilitatea și longevitatea la insulină la șoarecii GHRKO?

Rezultate si discutii

Caracteristicile de longevitate ale șoarecilor normali și GHRKO pe CR ușoară

Pentru a determina dacă răspunsurile diferențiale documentate anterior ale șoarecilor GHRKO și șoareci normali (N) la 30% CR ar fi putut fi limitate la acest nivel de restricție dietetică, am efectuat un studiu suplimentar de longevitate utilizând un grad mai mic de CR la ambii șoareci. Hrănirea zilnică (EOD) a dus la o reducere de aproximativ 10-15% a consumului mediu zilnic de alimente comparativ cu șoarecii martori ad libitum (AL) (date neprezentate) [21], [22]. La șoarecii masculi normali, hrănirea cu EOD a dus la o creștere cu 16% a duratei medii a vieții (N AL = 851 zile vs. N EOD = 1010 zile, raportul de risc (HR) 2,62 interval de încredere (CI) 1,31-6,03). În schimb, durata medie de viață a șoarecilor GHRKO nu a fost extinsă (KO AL = 1178 zile față de KO EOD = 1158 zile, HR 1,063, CI 0,50-2,29). Comparativ cu șoarecii N AL, hrănirea cu EOD a crescut durata totală de viață la șoarecii normali, așa cum a fost evaluată prin analiza log-rank (P Figura 1. Parametrii metabolici ai șoarecilor masculi GHRKO (KO) și normali (N) hrăniți ad libitum (AL) sau supuși 30 % restricție de calorii (CR) timp de un an.

Panoul (A) arată schimbările de timp ale greutății corporale pe o perioadă de un an. După un an de RC, toate grupurile au fost postite peste noapte și s-au determinat greutatea corporală (B), glucoza periferică (C), insulina (D) și modelul homeostatic calculat (HOMA, E). Valorile cu supercripturi/litere diferite de acestea sunt semnificativ diferite (P Figura 2. Insulina hepatică de semnalizare în cascadă proteine ​​totale și fosfo-proteine ​​ca răspuns la stimularea insulinei (10 UI/kg) comparativ cu martorii tratați cu soluție salină în GHRKO (KO) și normal (N ) șoareci hrăniți ad libitum (AL) sau cu 30% restricție calorică (CR) timp de un an.

S-au efectuat ELISA cu anticorpi direcționați către receptorul total de insulină (IR; A), IR pY1158 (B), AKT1 (D) și AKT1 pS473 (E). Omogenatele hepatice au fost imunoprecipitate (IP) cu anti-p85, separate folosind SDS-PAGE și nivelul fosforilării Tyr nespecifice a fost determinat la aproximativ 180 kDa folosind anti-pY99 (C). Proteina totală AKT2 (F) și AKT2 pS473/474 (G) au fost determinate din omogenate de proteine ​​hepatice supuse mai întâi IP folosind anti-AKT2. Panoul (H) rezumă fosfo-proteinele cheie stimulate de insulină în comparație cu șoarecii N AL stimulați de insulină. Benzile sunt pete reprezentative de la 4-6 șoareci masculi pe fenotip/dietă/grup de tratament. Valorile cu supercripturi/litere diferite sunt semnificativ diferite (P Figura 3. Abundența subunității ficatului PI3K în șoareci GHRKO (KO) și șoareci normali (N) hrăniți ad libitum (AL) sau 30% restricție calorică (CR) timp de un an.

Izolatele de proteine ​​hepatice au fost imunoprecipitate (IP) cu anti-pan-p85. Subunitățile totale p85α (A), 55α (B) și 50α (C) au fost separate folosind SDS-PAGE, transferate în membranele de nitroceluloză și șterse cu anti-pan-p85. Benzile sunt pete reprezentative de la 4-6 șoareci masculi pe fenotip/dietă/grup de tratament. Valorile cu supercripturi/litere diferite de acestea sunt semnificativ diferite (P Figura 4. Insulina musculară de semnalizare în cascadă proteine ​​totale și fosfo-proteine ​​ca răspuns la stimularea insulinei (10 UI/kg) comparativ cu martorii tratați cu soluție salină în GHRKO (KO) și normal (N ) șoareci hrăniți ad libitum (AL) sau 30% restricție calorică (CR) timp de un an.

Nivelurile receptorului total de insulină (IR; A), IR pY1158 (B), AKT1 (D) și AKT1 pS473 (E) au fost determinate folosind ELISA. Omogenatele hepatice au fost imunoprecipitate (IP) cu anti-p85, separate folosind SDS-PAGE și nivelul fosforilării Tyr nespecifice a fost determinat la aproximativ 180 kDa (corespunzător proteinelor IRS) folosind anti-pY99 (C). Proteina totală AKT2 (F) și AKT2 pS473/474 (G) au fost determinate din omogenate de proteine ​​hepatice supuse mai întâi IP folosind anti-AKT2. Proteina GLUT4 totală (H) a fost determinată în omogenatele musculare utilizând anti-GLUT4. Panoul (I) rezumă fosfo-proteinele cheie stimulate de insulină în comparație cu șoarecii N AL stimulați de insulină. Benzile sunt pete reprezentative de la 4-6 șoareci masculi pe fenotip/dietă/grup de tratament. Valorile cu supercript/literă diferită sunt semnificativ diferite (P Figura 5. Proteina totală musculară IRS-1 (A) și fosforilarea inhibitoare IRS-1 pS307 (B) la șoarecii GHRKO (KO) și normali (N) hrăniți ad libitum ( AL) sau 30% restricție calorică (CR) timp de un an a fost determinată folosind ELISA.

Barele reprezintă 6-8 animale pe fenotip/grup de dietă. Valorile cu supercripturi/litere diferite sunt semnificativ diferite (P Figura 6. Proteina mTOR totală musculară (A) și mTOR pS2448 (B) la șoarecii GHRKO (KO) și normali (N) hrăniți ad libitum (AL) sau 30% calorii restricție (CR) timp de un an au fost determinate folosind western blot.

Barele reprezintă 6-8 animale pe fenotip/grup de dietă.

Concluzie

În studiul de față, am abordat trei întrebări majore de cercetare: 1) Mutația GHRKO modulează sau elimină efectele diferitelor intensități ale CR asupra longevității? 2) Cum îmbunătățește CR sensibilitatea și longevitatea la insulină la șoarecii normali? și 3) De ce CR nu reușește să îmbunătățească sensibilitatea și longevitatea la insulină la șoarecii GHRKO?

La șoarecii normali pe CR, există o amplificare majoră a cascadei de semnalizare a insulinei, cu creșterea concentrației de proteine ​​și/sau activarea (stimulată de insulină) a aproape tuturor mediatorilor celulari de acțiune a insulinei testați în prezentul studiu (rezumat în Figura 7 ). Aceste creșteri ale cascadei de semnalizare a insulinei în ficat și mușchi arată că îmbunătățirile documentate anterior ale sensibilității la insulină la animale întregi ca răspuns la CR reflectă acțiunea crescută a cascadei de insulină. Am postulat anterior că sensibilitatea îmbunătățită la insulină la animale întregi este strâns legată de longevitatea extinsă [16].

Proteinele solide cenușii reprezintă activare stimulatoare, în timp ce proteinele solide negre sunt inhibitoare.

Colectiv, studiul de față identifică etapele moleculare ale semnalizării insulinei în ficat și în mușchi, care sunt afectate în mod similar de două afecțiuni care prelungesc viața, RC la animale normale și ștergerea receptorului GH, dar nu sunt modificate de CR la șoarecii GHRKO din care CR nu reușește să crească sensibilitatea la insulină și, prin urmare, longevitatea. Aceasta include patru parametri în ficat și 8 în mușchi (plus unul modificat de CR în direcțiile opuse în cele două fenotipuri). Sugerăm că acești pași de semnalizare a insulinei sunt implicați în controlul sensibilității la insulină la animale întregi și a longevității mamiferelor.

Materiale și metode

Animale

GHRKO și șoareci normali au fost produși în colonia de reproducere din SIU-SOM Springfield, IL, care a fost dezvoltat din șoareci furnizați cu amabilitate de J. J. Kopchick (Universitatea Ohio, Atena). Frații normali din punct de vedere fenotipic ai șoarecilor GHRKO au servit drept controale în aceste studii. Animalele au fost înțărcate la vârsta de 3 săptămâni și plasate pe Lab Diet Formula 5001 (Ralston Purina, St. Louis, MO). Animalele au fost adăpostite la 20-23 ° C pe un ciclu de lumină/întuneric de 12/12 ore. Animalele santinelă au fost trimise la teste serologice la fiecare 3 luni, iar rezultatele au fost uniform negative. Aceste studii au fost aprobate de Comitetul de utilizare și îngrijire a animalelor de laborator al SIU-SOM.

Studiul longevității

Paradigma de hrănire din două în două zile (EOD) a fost efectuată la șoareci normali și GHRKO începând cu vârsta de aproximativ 8 săptămâni. Șoarecii au fost trecuți treptat la EOD plasându-i în fiecare a treia zi de repaus în prima săptămână și apoi hrănindu-se cu EOD pe tot restul studiului. Supraviețuirea șoarecilor masculi utilizați în acest studiu (aproximativ 15-20 pe fenotip/tratament dietetic) a fost evaluată odată ce toate cele patru grupuri au atins durata medie de viață. La momentul analizei, restul de supraviețuitori din acest studiu încă în desfășurare erau 6% din N AL, 43% din N CR, 41% din KO AL și 46% din șoarecii KO CR. A fost efectuată analiza log-rank pentru supraviețuirea parțială. La momentul analizei, toate grupurile de tratament feminin nu atingeau încă durata medie de viață. Animalele din studiul de longevitate au fost verificate zilnic pentru sănătate și supraviețuire și au fost tratate numai pentru modificări ale cuștii și măsurători corporale bi-săptămânale. Animalele care au apărut aproape de moarte (apatice, incapabile să meargă și reci la atingere) sau au avut o creștere neoplazică sângerândă mare care se apropia de 10% din greutatea lor corporală au fost eutanasiate, iar data eutanasiei a fost considerată data morții.

Parametrii metabolici

La șoarecii din studiul terminal de stimulare a insulinei, parametrii metabolici au fost evaluați din sângele colectat din plexul orbital după 10 luni de 30% CR. După un post de 12 ore, animalele au fost anesteziate cu izofluran (Abbott Laboratories, Chicago, IL) și nivelurile de glucoză au fost determinate cu ajutorul unui glucometru (Lifescan, Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ.) Și nivelurile de insulină au fost determinate folosind o enzimă test imunosorbant (ELISA, Crystal Chem. Inc., Downers Grove, IL). Scorul modelului homeostatic de evaluare (HOMA) a fost calculat ca 22,5/[insulină [mU/L] X glucoză [mmol/L].

Studiu de stimulare a insulinei

Șoarecii GHRKO și frații de sex feminin normali din punct de vedere fenotipic au fost restricționați treptat de calorii începând cu vârsta de 8 săptămâni, primind 90% din cantitatea de alimente consumată de controalele AL în săptămâna inițială, 80% săptămâna următoare și 70% pentru restul studiu. După un an de 30% CR, șoarecii din toate cele 4 grupuri (N AL, N CR, KO AL și KO CR, n = 15-18 pe grup) au fost anesteziați [ketamină (100 mg/ml): xilazină (20 mg )/ml), la 0,1 ml la 10 grame de greutate corporală] și injectat în vena cavă inferioară fie cu 10 UI/kg de insulină porcină (Sigma, St. Louis, MO), fie cu soluție salină (martor). Țesuturile musculare ale ficatului și ale membrelor posterioare au fost extrase și congelate rapid la 1 și respectiv 3 minute, după injectare.

Determinarea proteinelor și fosfoproteinelor

După depozitare la -80 ° C, țesuturile hepatice și musculare în T-Per (Pierce, Rockford, IL) cu inhibitor de fosfatază (Pierce, Rockford, IL) și inhibitori de protează (Sigma, St. Louis, MO) la aproximativ 1 ml pe 1 g de țesut. ELISA pentru insulină (CrystalChem, Downers Grove, IL), IR, IR pY1158, IRS-1, IRS-1 pS312, AKT1 și AKT1 pS473 au fost utilizate pentru cuantificarea proteinelor celulare în conformitate cu instrucțiunile producătorului (Biosource Camarillo, CA).

Pentru imunoprecipitare (IP), cantități egale de proteină solubilizată au fost incubate la 4 ° C peste noapte cu ∼4ug/ml de anticorp specific. Complexele polipeptidă-imuneglobină au fost apoi colectate prin incubare cu mărgele de proteină A-sefaroză (Sigma, St. Louis, MO) tampon de solubilizare A spălat și fierte în tampon de probă Laemmli (Biorad, Hercules, CA). Anticorpii (Ab) împotriva pan p85, AKT2, AKT (pS473), mTOR, mTOR (pS2448) și GLUT4 (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA) au fost utilizați conform sugestiilor producătorului. Fosforilarea IRS Tyr nespecifică a p85 a fost determinată prin detectarea semnalului anti-pY99 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) în regiunea ∼180 kDa în imunoprecipitații anti-pan p85.

Imunoblotarea a fost efectuată conform protocolului standard. Conținutul de proteine ​​din omogenatele tisulare extrase cu T-Per (descris mai sus) a fost determinat prin testul proteinei BCA (Pierce, Rockford, IL). Lizatele de proteine ​​(40-60 ug) au fost supuse SDS-PAGE utilizând geluri prefabricate Criterion XT (BioRad, Hercules, CA), transferate pe membranele de nitroceluloză (BioRad, Hercules, CA) și chiar încărcarea a fost verificată folosind MemCode Reversible Protein Stain Kit ( Pierce, Rockford, IL). Membranele au fost blocate timp de 1 oră la temperatura camerei cu 5% lapte uscat degresat sau 3% BSA la determinarea proteinelor fosforilate, în TBST (TBS + 0,05% Tween-20). Bloturile au fost apoi spălate cu TBST și incubate cu Ab primar diluat în soluția adecvată de blocare specifică Ab sugerată de producător. Reactivul chimiluminiscent ECL Plus a fost utilizat pentru imunodetecție (G.E. Healthcare Bio-sciences Corp., Piscataway, NJ). Imaginile digitale ale bloturilor au fost capturate folosind o cameră CCD (Hitachi Genetic Systems, Ameda, CA) și cuantificate utilizând software-ul GeneTools (SynGene, Cambridge, Anglia).

analize statistice

Curbele de supraviețuire Kaplan-Meier au fost utilizate pentru analiza supraviețuirii folosind testul log-rank pentru a evalua semnificația supraviețuirii între grupuri. Durata medie de viață reprezintă vârsta la care 50% din populația din grupuri a rămas în viață și a fost raportată cu raportul de risc corespunzător (HR) și intervalul de încredere (CI). Analiza dietei cu fenotip X a fost utilizată pentru a releva interacțiunile factorilor de caracterizare asupra fenotipului analizat, cu teste t independente ulterioare ale Studentului pentru comparații de grup. Analiza concentrației bazale și a insulinei stimulate de proteine ​​în toate grupurile a fost analizată cu analiza în trei direcții a varianței (ANOVA) urmată de testele ANOVA și studenții t în două grupuri ulterioare, în cadrul grupurilor, atunci când este justificat. Toate statisticile au fost realizate folosind versiunea SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL) cu α = 0,05. Toate graficele au fost realizate folosind Prism 4.02 (GraphPad Software, San Diego CA.). Alfa este setat la 0,05. Cu excepția datelor de longevitate, toate valorile sunt raportate ca medie ± Eroare standard a mediei (SEM) în cifre și text.

Mulțumiri

FP Dominici este investigator de carieră de la CONICET din Argentina. Autorii vor să mulțumească Fieja Wang și Marty Wilson pentru asistență în laborator și lui Steve Sandstrom pentru asistență editorială.

Contribuțiile autorului

Conceput și proiectat experimentele: MSB FPD AB. Experimentele efectuate: MSB FPD OA JSR KAR RW AS JP. Analiza datelor: MSB. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: MSB KAR MMM JJK. Am scris lucrarea: MSB FPD AB.