Abstract

Multe studii experimentale (1,2,3,4) și clinice (5,6,7,8,9) documentează un rol patogenetic al vasoconstrictorului puternic și al agentului mitogen endotelină-1 (ET-1) în bolile cardiovasculare. Un efect benefic al antagoniștilor receptorilor ET-1 a fost observat în insuficiența cardiacă congestivă (10,11,12). În acest context, efectele antagoniștilor receptorilor ET asupra structurii și funcției cardiace sunt de interes.

nepotrivirea

În hipertrofia ventriculară stângă (LVH), cardiomiocitele tind să depășească aportul capilar (13,14,15,16), ducând la nepotrivire capilar-miocit. Acest lucru a fost deosebit de bine documentat în insuficiența renală cronică, atât la animale (17,18), cât și la oameni (19). În modelul insuficienței renale, se știe că geneza LVH este parțial independentă de creșterea TA (20). Cu toate acestea, nu s-a determinat dacă antagoniștii receptorilor ET afectează capilarizarea cardiacă în raport cu masa ventriculară stângă (adică raportul capilar-miocit, care este un factor determinant important al aportului de oxigen cardiomiocitar).

Deoarece există dovezi că sistemul ET local este activat în LVH (1,2,3,4,5), am motivat că LVH uremic a furnizat un model convenabil pentru a examina ipoteza că un antagonist selectiv al receptorilor ETA previne nepotrivirea capilară-miocit în inimile șobolanilor cu insuficiență renală cronică. În acest scop, am comparat efectul blocantului specific al receptorului ETA LU 135252 (și al inhibitorului enzimei de conversie a angiotensinei [ACE] trandolapril ca control) asupra densității lungimii capilare cardiace.

Materiale și metode

Animale

Protocolul pentru acest studiu este conform cu liniile directoare pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator publicate de Institutul Național de Sănătate și a fost aprobat de comitetul etic local.

Proiectare experimentală

Șobolani masculi Sprague-Dawley în vârstă de nouă săptămâni (SD, 220 g; Janvier, Le Genest St. Isle, Franța) au fost adăpostiți în cuști individuale la temperatură constantă (22 ° C) și umiditate (50%) și au fost expuși la o Ciclu de întuneric/lumină de 12 ore. Animalele au avut acces gratuit la o dietă scăzută de nitrozamină (1% NaCl, furaje pudrate Ssniff M/R, Sniff Spezialitäten GmbH, Soest, Germania) și apă. După 3 zile de adaptare, animalele au fost alocate aleatoriu la nefrectomie subtotală (SNX) sau operație simulată (simulată). Mai întâi, rinichiul drept a fost îndepărtat sub anestezie cu ketamină/diazepam (100 mg/kg sau 2,5 μg/kg, respectiv), apoi rinichiul stâng a fost resectat subtotal prin îndepărtarea a două treimi (în greutate) a rinichiului contralateral, în principal prin rezecția țesut cortical. Operația simulată a animalelor de control a constat în decapsularea rinichiului, având grijă specială ca suprarenalele să nu fie deteriorate. La 24 de ore după operație, animalele au fost alocate aleatoriu diferitelor grupuri de tratament. Au fost efectuate două experimente separate.

Experimentul I: Studiu biologic imunohistochimic și molecular. Animalele au fost repartizate aleatoriu în cele două grupuri experimentale (10 animale pe grup): (1) controale acționate în mod fals și (2) SNX netratat. Greutatea corporală, aportul de alimente și apă și TA sistolică au fost determinate înainte de operație și în două intervale săptămânale în timpul studiului. Măsurătorile TA au fost efectuate la animale conștiente folosind pletismografia cozii. Înainte de terminarea experimentului, animalele au fost plasate în cuști metabolice individuale și s-au efectuat colectări de urină 24 de ore pentru determinarea volumului de urină, proteinuriei, clearance-ului creatininei și concentrațiilor imunoreactive de ET-1.

Pregătirea țesuturilor. La sfârșitul experimentului, aorta abdominală a fost cateterizată sub anestezie cu ketamină/diazepam (100 mg/kg sau 2,5 μg/kg, respectiv) și s-au prelevat probe de sânge pentru determinarea parametrilor serici și a nivelurilor plasmatice ale medicamentelor utilizate. Apoi perfuzia vasculară retrogradă a fost efectuată cu NaCI rece cu gheață la o presiune controlată așa cum este descris în detaliu în altă parte (21). Inimile au fost împărțite în trei felii orizontale și congelate în azot lichid pentru imunohistochimie, măsurători PCR și hibridizare in situ. Au fost determinate hematocritul, creatinina serică, creatinina urinară și renina plasmatică (22).

Imunohistochimie. Secțiunile înghețate (5 μm) au fost fixate în acetonă la 4 ° C. Colorarea imunohistologică a fost efectuată folosind un anticorp policlonal ET-1 neconjugat (Bio Trend GmbH, Köln, Germania). Pentru a reduce colorarea nespecifică a fundalului, secțiunile au fost incubate timp de 20 de minute la 37 ° C în factorul de demascare a țesutului. Probele au fost apoi clătite în soluție salină tamponată cu Tris (TBS, pH 7,6) și supuse sistemului avidin-biotină. Pe scurt, lamelele au fost incubate cu anticorpul primar la o diluție de 1:25 timp de 60 min la temperatura camerei. Anticorpul secundar (biotina imunoglobulinei anti-iepure de capră; Biogenex, San Ramon, CA) a fost aplicat timp de 30 de minute. Apoi secțiunile au fost incubate timp de 30 de minute la temperatura camerei cu streptavidină conjugată alcalină-fosfatază labilă super-sensibilă (Biogenex). Fiecare etapă de incubație a fost urmată de o clătire dublă aprofundată în TBS. Substratul roșu rapid (Dako GmbH, Hamburg, Germania) a servit drept cromogen. Ulterior, secțiunile au fost contracolorate cu hematoxilină și examinate prin microscopie cu lumină. Anticorpul utilizat a fost testat pentru specificitate la șobolan. Controalele negative au fost efectuate prin omiterea anticorpului primar. Colorarea secțiunilor de control și SNX a fost efectuată în aceeași perioadă pentru a reduce variațiile de intensitate a colorării.

Oligonucleotide. Am amplificat receptorul ETA (ET-AR) și receptorul ETB (ET-BR) folosind oligonucleotidele date de Liefeldt și colab. (23). Pentru ET-AR, am folosit ca grund de sens 5'-TGGGAATGGTGGGGAATG CAACTCT-3 'și ca grund antisens 5'-GAGCGCAGAGGTTGAGGACGGTGA-3', rezultând un produs PCR cu lungimea de 258 bp. Pentru ET-BR, primerul de sens a fost 5'-TTGGAGCTGAGATGT GTAAGC-3 'și primerul antisens a fost 5'-CAGTGAAGCCATGTTGATACC-3', rezultând un produs de amplificare de 625 pb. Pentru ET-1, primerul de sens a fost 5'-TGGCTTTCCAAGGAGC TCC-3 'și primerul antisens a fost 5'-GCTTGGCAGAAATTCCAGC-3', rezultând un fragment PCR de 339 bp.

PCR competitiv. Cuantificarea mARN-ului ET-1, ET-AR și ET-BR a fost efectuată utilizând mutanți de ștergere ai ADNc ET-1, ET-AR și ET-BR ca standard intern. Mutanții de ștergere clonați au fost un cadou de la Dr. L. Liefeldt (23). Amplificarea mutanților a dus la produse PCR de 295 bp pentru ET-1, 227 bp pentru ET-AR și 557 bp pentru ET-BR. ADNc-urile mutante au fost adăugate la amestecul PCR după RT pentru a concura cu ET-AR endogen și respectiv ET-BR. Pentru cuantificarea ET-AR, s-au adăugat 0,5 pg de plasmidă la amestecul PCR per probă, pentru ET-BR 2 pg și pentru ET-1 2,5 pg. Pentru fiecare animal, au fost efectuate patru PCR competitive pentru ET-AR și, respectiv, ET-BR.

Analiza fragmentelor PCR. Cantitățile relative de mRNA ET-1, ET-AR și ET-BR în fiecare probă au fost cuantificate în conformitate cu o modificare a metodei descrise de Wagner și colab. (24). Douăzeci de microlitri ai produselor de amplificare au fost separați electroforetic pe geluri de agaroză 3% (Life Technologies BLR). Imaginile bromurii de etidiu - benzile colorate pentru ET-1, ET-AR și ET-BR și ADNc-urile lor mutante respective au fost digitalizate cu un sistem de documentare pe gel (Intas Co., Göttingen, Germania), iar intensitățile benzilor au fost măsurată densitometric cu programul National Institutes of Health IMAGE 1.44. Pentru fiecare reacție, a fost calculată relația intensității benzii de ADNc endogene cu banda respectivă de ADNc mutantă. Pentru fiecare animal, a fost calculată media a patru reacții.

Hibridizarea in situ. Pregătirea țesuturilor: Pentru hibridizarea in situ, secțiunile criostatului (10 μm) au fost montate în dezgheț pe lamele silanizate și fixate timp de 5 minute la 4 ° C în soluție salină tamponată 3% paraformaldehidă/fosfat (pH 7,0). Deproteinarea a fost efectuată în HCI 0,2 M timp de 15 min. Pentru a reduce colorarea nespecifică a fundalului, secțiunile au fost acetilate timp de 20 min în 0,25% anhidridă acetică (vol/vol) în 0,1 M trietanolamină (pH 8,0). Ulterior, secțiunile au fost deshidratate în alcooli clasificați, uscați la aer și depozitați la -20 ° C până la utilizare.

Hibridizare in situ: Secțiunile au fost hibridizate cu 4 ng de sondă marcată în tampon conținând 50% formamidă deionizată, 20 mM Tris-HCI (pH 7,6), 0,33 M NaCI, 0,1 M ditiotreitol, 1 mM EDTA, 10% sulfat de dextran, 0,5 mg/ml ARNt, 0,1 mg/ml poli-A-ARN, 1 × soluție Denhardt (0,02% Ficoll 400, 0,02% albumină serică bovină, 0,02% polivinilpirolidonă) într-o cameră umedă. Hibridizarea sondei cu ARNm nativ a fost permisă timp de 18 ore la 50 ° C. Etapele posthibridizării au inclus îndepărtarea sondei nelegate în 1 × citrat salin standard (SSC) la 50 ° C, două spălări ulterioare în 2 × SSC/50% formamidă timp de 1 oră la 50 ° C, tratament cu RNază A (20 μg/ml) în 0,5 M NaCI, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 1 mM EDTA, timp de 30 min la 37 ° C și se spală timp de 10 min în 1 × SSC la 37 ° C și, respectiv, temperatura camerei.

Detectarea imunohistologică a sondelor hibridizate: După spălări posthibridare, secțiunile au fost echilibrate în tampon I (0,1 M Tris-HCI, 0,15 M NaCI [pH 7,5]). Colorarea de fundal nespecifică a fost blocată prin incubare timp de 1 oră cu 0,5% reactiv de blocare/tampon I (Boehringer Mannheim). Produsele de hibridizare au fost vizualizate prin imunoanaliză legată de enzime folosind fragmente antidigoxigenină-Fab de oaie conjugate cu fosfatază alcalină (Boehringer Mannheim, 750 U/ml) la o diluție de 1: 300 în soluție de blocare. După incubare peste noapte la 4 ° C, conjugatul nelegat a fost îndepărtat prin două spălări în tamponul I urmat de echilibrarea secțiunilor din tamponul II (0,1 M Tris-HCI, 0,1 M NaCI, 50 mM MgCl2 [pH 9,5]). Tetrazoliul nitro-albastru și 5-brom-4-clor-3-indolil fosfatul au servit drept cromogeni. Controalele negative au inclus hibridizarea cu sonda ARN sens, incubația fără sondă pentru detectarea legării nespecifice a anticorpului primar și omiterea atât a sondei, cât și a anticorpului primar.

Experiment 2: Studiu stereologic. Animalele au primit fie antagonistul receptorului ETA activ oral oral LU 135252 (26), fie inhibitorul ECA (ACE-i) trandolapril (Knoll AG, Ludwigshafe/Rhein, Germania). Medicamentele au fost administrate în dietă. S-a măsurat consumul zilnic de alimente, iar dozele de medicamente au fost determinate de cantitatea reală de alimente consumate. În plus, nivelurile plasmatice ale ambelor medicamente au fost măsurate prin cromatografie lichidă de mare putere la patru animale supuse unei operații simulate și la patru animale supuse SNX (27).

Protocolul acestui braț al studiului a cuprins următoarele grupuri (10 animale pe grup): (1) controale acționate de fals (simul), (2) simul + antagonist al receptorilor ETA (LU 135252 20 mg/kg pe zi oral, sham + ET-RA), (3) SNX netratat (SNX), (4) SNX + antagonist al receptorilor ETA (LU 135252 20 mg/kg pe zi oral, SNX + ET-RA) și (5) SNX + ACE -i (trandolapril 0,3 mg/kg pe zi pe cale orală, SNX + ACE-i).

La sfârșitul perioadei de observare de 15 săptămâni, animalele au fost plasate în cuști metabolice. Colecțiile de urină de 24 de ore au fost efectuate ca în experimentul 1.

Măsurători telemetrice ale TA. Presiunea arterială medie (MAP), presiunea arterială sistolică (SAP), presiunea arterială diastolică (DAP), ritmul cardiac (HR, derivat din semnalul de vârf sistolic BP, min -1) și activitatea motorie a animalelor (U/10 min) au fost măsurate utilizând un sistem de telemetrie (Data Sciences Inc., St. Paul, MN) la patru animale pe grup conform Brockway și colab. (28). Transmițătoarele (TL 10-M2-C50-PE, TL11-M2-C50-PXT) au fost implantate în aorta abdominală și doi electrozi au fost implantați subcutanat (28). Receptoare (RLA 1000, RA 1000) au fost plasate sub cușcă. Gama maximă a emițătorului a fost de 40 cm.

Pregătirea țesuturilor. La sfârșitul experimentului, fixarea perfuziei retrograde a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus. În loc de NaCl răcit cu gheață, s-a folosit glutaraldehidă 3% (29). După perfuzie, inima fiecărui animal a fost scoasă pentru determinarea greutății și a volumului, iar prelevarea de probe de țesut și colorarea secțiunii au fost efectuate în conformitate cu metoda orientatorului (29,30). Eșantionarea uniformă aleatorie a fost realizată prin pregătirea unui set de felii echidistante ale ventriculului stâng și septului interventricular cu un start aleatoriu. Două felii au fost selectate prin eșantionare ponderată pe suprafață și prelucrate folosind metoda orientatorului. Secțiunile de semitină (1 μm) au fost preparate și colorate cu albastru de metilen și fucsină de bază.

Stereologia cantitativă. Toate investigațiile au fost efectuate într-o manieră orbită (adică, observatorul nu știa protocolul). Densitatea de lungime (Lv) a capilarelor (adică lungimea capilarelor pe unitatea de volum de țesut) a fost măsurată pe opt secțiuni de semitină orientate diferențial pe animal, așa cum este descris în detaliu în altă parte (29,30). Lungimea capilară totală per ventricul stâng a fost derivată din volumul Lv ori volumul ventricular stâng (volumul LV) (adică, greutatea ventriculară stângă [LVW] împărțită la greutatea specifică). Distanța intercapilară (adică, distanța dintre centrele a două capilare intramyocardice adiacente) a fost calculată conform unei modificări a formulei lui Henquell și Honig (29,31). Tehnicile morfologice, cum ar fi numărarea transectelor capilare pe zonă a țesutului miocardic și numărarea punctelor sunt metode foarte reproductibile pentru analiza țesuturilor. Eroarea intraobservator a mijloacelor parametrilor stereologici (de exemplu, Lv capilar) este de 1%, în timp ce eroarea interobservator este de aproximativ 3%.

Statistici

Datele sunt date ca medie ± SD. După testarea pentru normalitate, testul ANOVA sau respectiv Kruskal-Wallis a fost ales pentru analiza varianței. Valoarea P din tabelele 1,2,3 se referă la eterogenitatea grupului de către ANOVA. S-a evaluat dacă diferențele dintre grupuri au fost semnificative folosind testul cu interval multiplu al lui Duncan. Rezultatele au fost considerate semnificative atunci când P a fost mai mic de 0,05.