Roluri Curarea datelor, Analiza formală, Investigație, Scriere - schiță originală, Scriere - revizuire și editare

intraperitoneală

Afiliere Beijing Advanced Innovation Center for Nutrition Food and Health Health, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing, China

Roluri Conceptualizare, Software

Afiliere Beijing Advanced Innovation Center for Nutrition Food and Health Health, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing, China

Roluri Curarea datelor

Afiliere Beijing Advanced Innovation Centre for Nutrition Food and Health Health, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing, China

Roluri Curarea datelor

Afiliere Beijing Advanced Innovation Center for Nutrition Food and Health Health, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing, China

Afilieri Beijing Advanced Innovation Centre for Food Nutrition and Human Health, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing, China, Laborator cheie de evaluare a siguranței organismelor modificate genetic (siguranța alimentelor), Ministerul Agriculturii, Beijing, China

Roluri Achiziție finanțare

Departamentul de afiliere a fiziologiei reproducerii, Academia de Științe Medicale din Zhejiang, Hangzhou, China

Afilieri Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Health Health, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing, China, Laborator cheie de evaluare a siguranței organismelor modificate genetic (siguranța alimentelor), Ministerul Agriculturii, Beijing, China

Roluri Conceptualizare, achiziție de fonduri, metodologie, scriere - recenzie și editare

Afilieri Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Health Health, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing, China, Laborator cheie de evaluare a siguranței organismelor modificate genetic (siguranța alimentelor), Ministerul Agriculturii, Beijing, China

  • Haoyu Li,
  • Chuanhai Zhang,
  • Junyu Liu,
  • Wenya Xie,
  • Wentao Xu,
  • Fei Liang,
  • Kunlun Huang,
  • Xiaoyun He

Corecţie

5 decembrie 2019: Li H, Zhang C, Liu J, Xie W, Xu W și colab. (2019) Corecție: Administrarea intraperitoneală de folistatină promovează rumenirea adipocitelor la șoarecii obezi induși în dietă cu conținut ridicat de grăsimi. PLOS ONE 14 (12): e0226344. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226344 Vizualizați corectarea

Cifre

Abstract

Odată cu dezvoltarea economică rapidă, prevalența obezității a crescut remarcabil la nivel mondial. Obezitatea poate induce o varietate de boli metabolice, cum ar fi ateroscleroza, diabetul, hipertensiunea și bolile coronariene, care pun în mod semnificativ sănătatea și bunăstarea persoanelor. Țesuturile grase maro și bej joacă un rol important în termogeneza la mamifere. Studii recente au arătat că folistatina (FST) poate induce potențial rumenirea țesutului adipos alb (WAT). În acest studiu, șoarecii obezi induși în dietă bogată în grăsimi au fost injectați cu folistatină timp de o săptămână pentru a investiga efectele folistatinei asupra rumenirii și metabolismului și pentru a determina mecanismul. Rezultatele au arătat că folistatina a suprimat obezitatea cauzată de o dietă bogată în grăsimi și o sensibilitate crescută la insulină, cheltuieli energetice și rumenirea subcutanată a grăsimilor. Efectele benefice au rămas chiar și după o perioadă de retragere. Follistatina a promovat secreția de irisină din grăsimea subcutanată prin calea semnalului AMPK-PGC1α-irisină, care induce rumenirea WAT ​​și a activat calea insulinei în grăsimea bej, promovând astfel metabolismul.

Citare: Li H, Zhang C, Liu J, Xie W, Xu W, Liang F și colab. (2019) Administrarea intraperitoneală de folistatină promovează rumenirea adipocitelor la șoarecii obezi induși în dietă cu conținut ridicat de grăsimi. PLoS ONE 14 (7): e0220310. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220310

Editor: Kai Sun, Universitatea din Texas Health Science Center din Houston, STATELE UNITE

Primit: 17 decembrie 2018; Admis: 12 iulie 2019; Publicat: 31 iulie 2019

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în manuscris și cifre.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de principalele proiecte speciale privind cultivarea organismelor modificate genetic (numărul grantului: 2018ZX0801106B) către XH, Fundația pentru Științe Naturale din provincia Zhejiang (LQ14C120001) și Fondul Național de Științe Naturale pentru Young Scholar (81501241) către FL. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Țesutul adipos maro (BAT) joacă un rol important în termogeneza care nu tremură, în special la nou-născuți [1]. BAT este diferită de WAT în ceea ce privește metabolismul energetic. WAT stochează energie în principal sub formă de trigliceride în perioadele de consum excesiv de energie, unde BAT eliberează căldură prin promovarea consumului de trigliceride și glucoză [2]. BAT se caracterizează prin acumularea de grăsime sub formă de picături de lipide multiloculare și prezența a numeroase mitocondrii care conțin o proteină termogenică unică numită proteina de decuplare 1 (UCP1). UCP1 este exprimat abundent în mitocondriile BAT BAT la mamifere și poate arde combustibili chimici prin decuplarea respirației celulare pentru a se apăra împotriva obezității [3].

Când adipocitele albe sunt stimulate de factori specifici, cum ar fi frigul sau β3-adrenoceptorul, dimensiunea adipocitelor albe se micșorează, producția de căldură crește, iar adipocitele încep să se rumenească în celule bej [4]. Țesutul adipos bej este similar cu BAT în morfologie și funcție, deoarece este format din picături de lipide multiloculare și conține un număr mare de mitocondrii. În plus față de UCP1, alte gene cheie selective BAT sunt foarte exprimate, cum ar fi Prdm16, Pgc1α și Pparγ. Aceste proteine ​​selective BAT pot promova metabolismul lipidic și pot crește consumul de energie [5, 6]. Este bine stabilit că BAT și grăsimea bej pot îmbunătăți sensibilitatea la insulină și pot scădea greutatea corporală la oameni și animale experimentale. În plus, nivelurile ridicate ale proteinelor CD137 și TMEM26 sunt exprimate în grăsimi bej, care sunt markeri selectivi cheie în țesutul adipos bej.

La șoarecii FST supraexprimând, masa BAT a crescut, iar expresia proteinelor selective BAT și bej-selective în WAT a crescut, indicând formarea țesutului adipos bej. În același timp, nivelurile de expresie ale fosforilării pp38MAPK/pERK1/2 au crescut [16]. Inhibarea căii pp38MAPK/pERK1/2 în celulele 3T3-L1 împiedică reglarea în sus a proteinei UCP1 indusă de FST, sugerând că FST poate induce rumenirea WAT ​​prin intermediul căii pp38MAPK/pERK1/2. Rumenirea WAT ​​a fost observată la șoarecii knockout MST, iar acest lucru s-a dovedit a fi prin activarea căii AMPK-PGC1α-Fndc5 în mușchi [12]. Domeniul fibronectinei de tip III conținând 5 (Fndc5), care este substanța precursoră a irisinei, acționează ca un factor muscular pentru a promova expresia grăsimii brune și a proteinelor de grăsime bej. Ca miokină nou definită, irisina poate promova expresia proteinelor selective BAT și bej-selective [17]. De fapt, Fndc5 nu este secretat doar în mușchi, ci și în WAT [18]. Ca inhibitor al MST, FST poate induce rumenirea WAT ​​prin calea AMPK-PGC1α-Fndc5 [19].

În prezent, există studii limitate de FST la animale, care au folosit vectori lentivirali pentru a construi un model FST-transgenic [16]. Deși acest model poate exprima în mod stabil niveluri ridicate de FST la șoareci pentru o perioadă extinsă de timp, metoda nu este adecvată pentru explorarea valorii medicamentoase a FST în utilizarea clinică. Deoarece FST este o proteină autocrină și paracrină care este secretată în sânge de diferite țesuturi și organe la mamifere [20], este posibil să îmbunătățim nivelul FST din sânge într-un timp scurt pentru a promova metabolismul și a regla homeostazia glicemiei la șoareci prin injecție externă de FST. În studiul actual, arătăm că o săptămână de injecție cu FST poate crește nivelurile metabolice și poate induce rumenirea WAT ​​subcutanată, posibil prin activarea căilor AMPK-PGC1α-Fndc5 și pp38MAPK/pERK1/2, iar acest efect a fost observat după oprirea injecțiilor pentru una. săptămână. Lucrarea actuală este valoroasă pentru aplicarea clinică a FST în activarea rumenirii WAT pentru tratamentul sindromului metabolic.

Sectiunea Experimentala

Animale

Șoareci masculi C57BL/6J în vârstă de patru până la șase săptămâni au fost obținuți de la Vital River Laboratories (Beijing). Modelul obezității a fost indus folosind o dietă bogată în grăsimi (HFD), care conținea 60% din energia furnizată de grăsimi. Proiectul experimental a fost aprobat de Comitetul de etică a animalelor din China Agricultural University, Beijing, iar ID-ul de aprobare al acestui studiu a fost KY20170027. Studiul a fost realizat într-o cameră specifică pentru animale fără patogeni specifică a Centrului de Supraveghere, Inspecție și Testare pentru Organisme Modificate Genetic din Ministerul Agriculturii (Beijing, China; numărul de licență SYXK (Beijing) 2015–0045). Camera animalelor a fost bine controlată, deoarece aerul a fost schimbat de 15 ori într-o oră, s-a menținut un program de 12 ore de lumină-întuneric, temperatura a fost controlată la 22 ± 2 ° C și umiditatea a fost controlată la 55% ± 10%. Chow-ul hrănit animalelor de experiment a fost cumpărat de la compania de biotehnologie Hufukang (Beijing). Compoziția și conținutul HFD sunt prezentate în Tabelul 1. Raportul în greutate și raportul de energie al dietelor experimentale sunt prezentate în Tabelul 2.

Experiment de injectare FST

Înainte de experiment, tuturor animalelor li s-a permis să se adapteze o săptămână la condițiile din camera animalelor și apoi au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi pentru următoarele 8 săptămâni pentru a induce obezitatea. După inducția cu conținut ridicat de grăsimi, 12 șoareci cu greutăți corporale similare au fost împărțiți în două grupe: Un grup a fost injectat intraperitoneal cu 8,5 μg/kg greutate corporală de șoarece recombinant Follistatin 288 (sisteme R&D, 769-FS-025) o dată pe zi timp de o săptămână, în timp ce celălalt grup a fost marcat ca control.

Experiment de retragere FST

Pentru a explora persistența efectului fiziologic al FST, alți 18 șoareci obezi induși în dietă bogată în grăsimi au fost împărțiți în 3 grupuri. Un grup de șoareci a fost marcat ca grupul de sevraj folistatin (grup FSTW), care a fost injectat intraperitoneal cu 8,5 μg/kg greutate corporală de FST o dată pe zi timp de o săptămână, dar nu a avut tratament de injectare pentru săptămâna următoare. Al doilea grup a fost injectat intraperitoneal cu același volum de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) o dată pe zi timp de o săptămână și nu a avut tratament de injectare pentru săptămâna următoare, acest lucru fiind marcat ca grupul de retragere PBS (grupul PBSW). Al treilea grup a fost injectat cu FST la fel ca primul grup și când a trecut prima săptămână, șoarecii din acest grup au fost sacrificați și WAT-ul lor subcutanat inghinal prelevat pentru analiza Western blot.

În toate experimentele, 3 șoareci din același grup au fost adăpostiți într-o cușcă cu acces gratuit la alimente și apă. Toate animalele au fost hrănite cu o dietă bogată în grăsimi și greutatea corporală a fost înregistrată o dată pe săptămână. La sfârșitul experimentului, șoarecii au fost sacrificați și sângele a fost colectat. WAT subcutanat inghinal a fost fixat utilizând paraformaldehidă 4% și congelat în azot lichid.

Temperatura rectală și imagistica în infraroșu

Șoarecii au fost plasați într-o cameră rece (4 ° C) timp de 4 ore și temperatura lor rectală a fost măsurată de senzorul de temperatură AT210 (Zhongyi Dapeng, Shenzhen, China). Apoi, fotografiile animalelor au fost făcute folosind o cameră portabilă cu infraroșu FLIR T600 (FLIR, Oregon, SUA) cu o tablă albă ca fundal.

Cheltuieli de activitate și energie

La sfârșitul experimentului de retragere FST, șoarecii au fost plasați într-un contor de activitate cu șase cuști. După o perioadă de aclimatizare de 12 ore, activitatea a fost măsurată timp de 24 de ore. În timpul măsurării activității, șoarecii au avut acces la HFD și apă.

La sfârșitul experimentului de retragere FST, șoarecii au fost plasați într-un contor de consum de oxigen cu șase cuști. După o perioadă de aclimatizare de 12 ore, consumul de oxigen (VO2) și producția de dioxid de carbon (VCO2) au fost măsurate pentru următoarele 24 de ore. Datele au fost înregistrate și raportul de schimb respirator (RER) și cheltuielile de energie (EE) au fost calculate utilizând formula (RER = VCO2/VO2, EE = VO2 × [3.815 + (1.23 × RER)] × 40.1868); unitatea utilizată a fost kj/kg/h [21, 22].

Test de toleranță intraperitoneală la glucoză

La sfârșitul experimentului (experimentul de injectare FST s-a încheiat într-o săptămână, iar experimentul de retragere FST s-a încheiat în două săptămâni), a fost efectuat un test de toleranță la glucoză intraperitoneală (GTT). Toate animalele au fost postite 16 ore și apoi li s-a administrat o injecție intraperitoneală de glucoză (1,5 g/kg greutate corporală). Nivelurile de glucoză din sânge au fost detectate la 0, 15, 30, 60 și 120 de minute după injectarea glucozei folosind glucometre (ACCU-CHEK, Performa) și a fost calculată zona de sub curbă (ASC) între 0 și 120 de minute.

Evaluarea modelului homeostaziei-rezistența la insulină

Nivelurile de insulină serică au fost determinate cu un kit ELISA pentru insulină (Beyotime, PI602). Evaluarea modelului de homeostazie-rezistența la insulină a fost calculată folosind formula [23]: concentrația de insulină din sânge (μg/L) × concentrația de glucoză din sânge (mg/dL)/22,5; concentrația de glucoză din sânge a fost măsurată la 0 min în GTT.

Colorarea hematoxilinei și eozinei și imunohistochimie

Țesutul adipos subcutanat fixat în 4% paraformaldehidă a fost tăiat la 1,0 cm × 1,0 cm × 0,3 cm prăjituri și încorporat în parafină. Fiecare țesut încorporat a fost apoi tăiat la 5 μm grosime, plasat pe lamele și colorat de hematoxilină și eozină (HE). Morfologia celulară a adiposului subcutanat a fost observată la microscop. Pentru colorarea imunohistochimiei (IHC), secțiunile de țesut au fost incubate cu tampon de blocare timp de 1 oră după recuperarea antigenului. Apoi, secțiunile de țesut au fost incubate peste noapte cu diluant care conține anticorpi primari Ucp1. După spălare cu TBST, probele au fost incubate timp de 60 de minute cu diluant conținând anticorpi secundari. Apoi, secțiunile de țesut au fost spălate și reacționate cu reactiv ECL.

Analiza qPCR în timp real

ARN-ul total a fost extras folosind Trizol. S-a adăugat adipos subcutanat congelat (0,1 g) în 1 ml Trizol și s-a folosit un omogenizator portabil pentru a rupe țesutul. Probele au fost centrifugate timp de 10 minute la 12.000 g, la supernatant s-au adăugat 0,2 ml de cloroform și probele au fost centrifugate timp de 15 minute la 12.000 g. Supernatantul a fost apoi amestecat cu 0,5 ml izopropanol și centrifugat timp de 10 minute la 12.000 g. Sedimentarea după centrifugare conținea ARN total, care a fost colectat pentru analize ulterioare.

Transcrierea inversă a ARN-ului a fost realizată folosind eliminarea ADN-ului One Step și kitul ADNc Synthesis Supermix (Transgen Biotech, AT311). QPCR în timp real (RT-qPCR) a fost realizat folosind kitul Green qPCR Supermix (Transgen Biotech, AQ101). Gena ciclofilinei a fost utilizată ca un control intern pentru a cuantifica expresia genelor producătoare BAT și a genelor producătoare bej și toți primerii au fost sintetizați de compania Beijing Ruibiotech. Grundele utilizate sunt prezentate în Tabelul 3 [24-26].

Western blot

Proteina totală din adipoză subcutanată a fost extrasă utilizând tampon de liză RIPA conținând 1 mM PMSF. Amestecul omogen a fost centrifugat la 10.000 g și concentrația de proteine ​​a supernatantului a fost detectată folosind un kit BCA (Beyotime Biotechnology, P0011). Soluția de proteină a fost apoi amestecată cu tampon de încărcare și încălzită timp de 5 minute în apă clocotită.

O cantitate egală din fiecare probă de proteină a fost încărcată și separată cu 12,5% SDS PAGE într-un rezervor de electroforeză. Apoi, proteina probei a fost transferată din gel într-o membrană PVDF. Membrana PVDF care transportă proteina a fost blocată cu 5% BSA. Western blot a fost efectuată folosind anticorpi de detectare corespunzători.

analize statistice

Datele au fost prezentate ca medie ± SEM, iar diferențele dintre grupuri au fost analizate prin testele t ale Student folosind GraphPad Prism 5.0. Dacă valoarea p a testului T a fost mai mică de 0,05, diferența a fost considerată semnificativă.

Rezultate

Injecția cu FST a scăzut greutatea corporală la șoarecii obezi

În experimentul cu injecție FST, șoarecii obezi induși în dietă bogată în grăsimi au fost injectați intraperitoneal cu FST o dată pe zi timp de o săptămână. Greutatea corporală și indicele de grăsime corporală au fost măsurate la începutul și la sfârșitul experimentului. Șoarecii injectați cu FST au avut o greutate corporală mai mică decât grupul martor, care nu a avut tratament FST (Fig. 1A), iar indicii de grăsime corporală ai șoarecilor FST injectați au fost semnificativ mai mici decât martorii (Fig. 1B). În plus, nu a existat nicio diferență semnificativă în aportul de alimente, care a fost de aproximativ 2 g de chow bogat în grăsimi pe zi, între cele două grupuri (Fig. 1C). Datele sugerează că injecția cu FST poate reduce greutatea corporală printr-un mecanism biologic care nu inhibă aportul de alimente.

A, șoarecii injectați FST au slăbit după o săptămână, comparativ cu grupul martor. B, injecția FST a scăzut indicele de grăsime corporală. C, Nu s-a observat nicio diferență semnificativă în aportul de alimente între grupul de injectare FST și grupul de control. Injecția D, GTT, FST a crescut nivelul metabolismului glicemiei la șoarecii DIO. E, zona sub curba GTT. Injecția F, HOMA-IR, FST a redus rezistența la insulină la șoarecii DIO. G-H, temperatura rectală și imagini în infraroșu la șoareci în mediul de 4 ° C: grupul de injecție FST a menținut o temperatură corporală mai ridicată în mediul rece comparativ cu grupul de control. Abrevieri: FST, grupul de injecție FST, care a primit o injecție de o săptămână de FST. Control, grupul de control, care nu a avut tratament în experimentul de injectare FST. Barele reprezintă media ± SEM, n = 6. * P Fig 2. Efectul injecției FST asupra rumenirii WAT subcutanat inghinal la șoareci DIO.

A, colorarea hematoxilinei și eozinei WAT subcutanat inghinal prelevată din cele două grupuri. După injectarea FST, dimensiunea adipocitelor a fost redusă semnificativ. B, colorarea IHC a controlului și a WAT ​​subcutanat inghinal FST utilizând un anticorp anti-UCP1. C-D, expresia markerilor BAT, inclusiv Ucp1, Pgc1α, Prdm16, Pparγ și markerii bej, inclusiv Tmem26 și Cd137, injectarea FST a crescut semnificativ expresia acestor gene în grăsimea subcutanată a șoarecilor DIO. Barele reprezintă media ± SEM, n = 6. * P Fig 3. Persistența FST asupra funcției fiziologice.