ARTICOLE DE CERCETARE

Administrarea intravenoasă de celule stromale mezenchimale multipotente derivate din măduva osoasă are un efect neutru asupra cardiomiopatiei diabetice induse de obezitate

Sebastián D. Calligaris și Paulette Conget

Institutul de Științe, Facultatea de Medicină, Clinica Alemana, Universitatea Desarrollo, Santiago, Chile.

Obezitatea este o problemă majoră de sănătate la nivel mondial. Pacienții obezi dezvoltă sindrom metabolic, care este un grup de caracteristici clinice caracterizate prin rezistență la insulină și dislipidemie. Manifestarea sa cardiacă, cardiomiopatia diabetică, duce la insuficiență cardiacă.
Celulele stromale mezenchimale multipotente derivate din măduva osoasă, denumite și celule stem mezenchimale (MSC) sunt concepute ca un instrument terapeutic nu numai pentru bolile cardiovasculare, ci și pentru alte afecțiuni degenerative.
Scopul nostru a fost de a evalua dacă administrarea intravenoasă de MSC modifică disfuncția cardiacă la șoarecii obezi. În acest scop, șoarecii C57BL/6 au fost hrăniți cu o dietă obișnuită (normală) sau bogată în grăsimi (obezi). Animalele obeze au primit vehiculul (obez), o doză unică (obeză + 1x MSC) sau trei doze (obeză + 3x MSC) de 0,5x10 6 MSC simgenic. La două până la trei luni după administrarea MSC, funcția cardiacă a fost evaluată prin cateterizare cardiacă, la starea bazală și după un stres farmacologic.
Comparativ cu șoarecii normali, șoarecii obezi au prezentat hiperglicemie, hiperinsulinemie, hipercolesterolemie și disfuncție cardiacă după starea de stres. MSC exogen nu a îmbunătățit și nici nu a afectat această disfuncție cardiacă.
Astfel, administrarea intravenoasă de MSC are un efect neutru asupra cardiomiopatiei diabetice induse de obezitate

Termeni cheie: Obezitate, sindrom metabolic, cardiomiopatie diabetică, celule stromale mezenchimale multipotente, funcție cardiacă, dobutamină.

INTRODUCERE

Obezitatea este o problemă majoră de sănătate la nivel mondial (Haidar și Cosman, 2011). Modificările stilului de viață, ingestia predominant de dietă hipercalorică și obiceiurile sedentare, produc o creștere dramatică a prevalenței sale. Majoritatea pacienților obezi dezvoltă sindrom metabolic, un grup de caracteristici clinice caracterizate prin rezistență la insulină și dislipidemie (Bonora și colab., 2003). Această afecțiune pre-diabetică a fost recunoscută ca un factor de risc independent pentru bolile cardiovasculare, în special hipertensiunea arterială, ateroscleroza și cardiomiopatia diabetică (Obunai și colab., 2007).

Cardiomiopatia diabetică a fost descrisă în 1972 ca insuficiență cardiacă fără semne de hipertensiune arterială, boală coronariană sau boală cardiacă valvulară sau congenitală (Rubler și colab., 1972). În ultimul deceniu a câștigat relevanță deoarece duce la insuficiență cardiacă (Asghar și colab., 2009); fiziopatologia sa nu este încă bine înțeleasă. Cu toate acestea, s-a raportat că acumularea de lipide a cardiomiocitelor le modifică metabolismul energetic, crescând stresul oxidativ, afectând manipularea calciului și disfuncția mitocondrială, care promovează moartea cardiomiocitelor și fibroza interstițială (Boudina și Abel, 2010). În prezent, tratamentele clinice pentru cardiomiopatia diabetică vizează întârzierea progresiei acesteia, în principal prin îmbunătățirea modificărilor metabolice utilizând agenți hipoglicemianți și a performanței cardiace utilizând blocanți β și inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei (Miki și colab., 2013). Prin urmare, noile terapii destinate inversării insuficienței cardiace la ambii indivizi ar avea un impact semnificativ asupra sistemului de sănătate (Bernardi și colab., 2012).

administrarea

MATERIALE ȘI METODE

Șoarecii masculi C57BL/6 au fost adăpostiți la temperatură constantă (22 ± 2 ° C) și umiditate (60%), cu un ciclu de lumină 12:12 ore: întuneric și acces nerestricționat la alimente și apă. La cerere, animalele au fost ușor anesteziate cu sevofluoran (Abbott Laboratories, Illinois, SUA) sau 60 mg/kg ketamină plus 4 mg/kg xilazină. Când au fost sacrificate, animalele au fost profund anesteziate și au primit o supradoză de ketamină/xilazină (60/4 mg/Kg). Protocoalele animale au fost aprobate de Comitetul de Etică al Școlii de Medicină, Clínica Alemana, Universidad del Desarrollo.

Inducerea obezității

Toți șoarecii au fost hrăniți cu o dietă obișnuită până la vârsta de o lună. Apoi au fost ținute la o dietă obișnuită (normală) sau au trecut la o dietă bogată în grăsimi (obezi) până la sfârșitul studiului (16 luni de dietă testată). Dieta obișnuită consta în până la 10 cal% grăsimi, 20 cal% proteine ​​și 70 cal% carbohidrați (Champion SA, Santiago, Chile). Dieta bogată în grăsimi consta în 60 cal% grăsimi, 20 cal% proteine ​​și 20 cal% carbohidrați (D12492, Research Diets Inc., NJ, SUA) (Calligaris și colab., 2013a; Ezquer și colab., 2011).

Cuantificarea glicemiei, insulinei, trigliceridelor și colesterolului

După patru ore de post, s-au recoltat probe de sânge din vena cozii șoarecilor alertați. Nivelurile de glucoză plasmatică au fost determinate cu sistemul glucometru Accu-Chek Performa (Roche Diagnostic, Germania). Nivelurile de insulină plasmatică au fost testate utilizând un kit ELISA de insulină de șoarece cu ultrasunete (Mercodia, Uppsala, Suedia). Nivelurile trigliceridelor și colesterolului plasmatic au fost determinate folosind kituri TG Color GPO/PAP și Colestat (Wiener Lab, Rosario, Argentina), respectiv (Ezquer și colab., 2011).

Evaluarea parametrilor cardiovasculari în condiții bazale și de stres

Șoarecii au fost profund anesteziați și așezați în decubit dorsal pe o placă termoreglată. Temperatura corpului a fost monitorizată folosind un termometru rectal și a fost furnizat oxigen gazos. Parametrii hemodinamici au fost măsurați prin cateterizare cardiacă (Calligaris și colab., 2013b; Lorenz și Robbins, 1997). Cateterul utilizat a fost un senzor de presiune Mikro-Tip SPR-671 (Millar, Houston, SUA) cuplat la un traductor PCU-2000 de presiune/volt (Millar) și conectat la un sistem de achiziție de date PowerLab 4/30 (AdInstruments, Bella Vista, Australia). Pentru evaluarea funcției cardiace în condiții de stres, un tub de plastic PE-10 (Warner Instruments Co, CT, SUA) a fost introdus în vena jugulară, conectat la o pompă KDS-KDS210P (Kdscientific Inc., MA, SUA) și dobutamină a fost perfuzată continuu la 12ng/g/min timp de două minute. Dobutamina este un agonist β-adrenergic cu o afinitate ridicată pentru receptorii β1 exprimați în inimă. Când este administrat sistemic, crește cererea cardiacă, producând stres cardiac. Datele obținute au fost analizate cu ajutorul software-ului LabChart 7Pro (AdInstruments, Bella Vista, Australia).

Izolarea MSC și expansiunea ex vivo

Șoareci femele C57BL/6 de șase până la opt săptămâni au fost sacrificați prin luxație cervicală. Celulele măduvei osoase au fost obținute prin spălarea femurilor și tibiilor cu PBS steril. După centrifugare, celulele au fost resuspendate în alfa-MEM (Gibco, NZ) suplimentat cu 10% ser fetal bovin selectat (Gibco) și 80 ug/ml gentamicină (Laboratorul Sanderson, Chile) și placate la o densitate de 1x106 celule nucleate/cm 2. Celulele neaderente au fost îndepărtate după 72 de ore prin schimbarea suportului. Când focarele au ajuns la confluență, celulele aderente au fost detașate cu 0,25% tripsină, 2,65 mM EDTA (Gibco), centrifugate și subculturate la 7.000 celule/cm2. După două subculturi, celulele aderente au fost caracterizate și transplantate (Ezquer și colab., 2008).

Fenotipul MSC administrat

Deoarece în prezent nu există markeri de consens pentru MSC murin ca și pentru MSC uman (Conget și Minguell, 1999; Dominici și colab., 2006), imunofenotiparea a fost efectuată prin analiză de citometrie în flux după imunocolorare cu anticorpi monoclonali împotriva CD45.2 (FITC-conjugat) de la BD Pharmingen, SUA, CD11b (PE-conjugat), Sca-1 (APC-conjugat) și CD90.2 PE -conjugat), toate din eBioscience, CA, SUA.

Potențialul de diferențiere MSC a fost evaluat după expunerea celulelor la medii standard de diferențiere adipogenă sau osteogenă timp de 14 și respectiv 21 de zile (Conget și Minguell, 1999). Imaginile au fost achiziționate cu un microscop Nikon T1-SM.

Administrare intravenoasă MSC

Un total de 0,5x106 MSC au fost resuspendate în 0,2 ml de plasmă de șoarece 5% și administrate prin vena cozii la șoareci ușor anesteziați. Animalele de control au primit 0,2 ml vehicul.

analize statistice

Datele sunt prezentate ca medie ± S.E.M. Pentru a determina semnificația statistică a diferențelor inter-grupuri, testul t Student a fost utilizat pentru a compara valorile medii între șoareci normali și obezi și ANOVA unidirecțional a fost utilizat pentru a compara valorile medii între toate grupurile. O valoare de p

REZULTATE

Parametrii metabolici ai șoarecilor obezi

În comparație cu șoarecii normali, șoarecii obezi au prezentat supraponderalitate, hiperglicemie, hiperinsulinemie și hipercolesterolemie, până la sfârșitul perioadei de studiu (Tabelul 1).

Fenotipul MSC administrat MSC administrate au fost CD45 -, CD11b -, Sca-1 + și CD90.2 + (Figura 2A); s-au diferențiat în adipocite (celule neutre care conțin picături lipidice) și osteoblaste (celule secretoare de hidroxil-apatit), îndeplinind criteriile definiției MSC de șoarece (Figura 2B) și colab., 2008).

Funcția cardiacă a șoarecilor obezi după administrarea MSC

În condiții bazale, nu s-au observat modificări semnificative în capacitatea cardiacă contractilă (dP/dtmax) sau de relaxare (dP/dtmin) între șoarecii normali și obezi (Figura 3A).

Când funcția cardiacă a fost evaluată după un stres farmacologic (stimularea dobutaminei), șoarecii obezi au prezentat o reducere semnificativă statistic a ambilor parametri hemodinamici în comparație cu șoarecii normali (Figura 3B).

MSC-urile exogene nu au modificat în mod semnificativ performanța cardiacă a șoarecilor obezi în condiții bazale sau după stimularea dobutaminei (Figura 3B). Când valorile dP/dtmin și dP/dtmax obținute în condiții bazale au fost comparate cu datele obținute în condiții de stres, s-a observat că animalele obeze care au primit trei doze de MSC au experimentat o creștere ușoară, dar nu semnificativă, a pdp/dtmin (dobutamme- bazal), sugestiv pentru o îmbunătățire a funcției (normal: 3.231 ± 1.000; obez: 1.609 ± 758; obez + 1x MSC: 1.883 ± 632; obez + 3x MSC: 2.423 ± 886).

DISCUŢIE

Cardiomiopatia diabetică este dezvăluită prin remodelare cardiacă (hipertrofie concentrică), fibroză, disfuncție diastolică și sistolică progresivă și rezerve contractile afectate în performanța testului de stres (Abel și colab., 2008; Daniels și colab., 2010). Aceste modificări cardiace au fost legate de creșterea stresului oxidativ, modificarea homeostaziei calciului, disfuncție mitocondrială progresivă începând cu o reducere a producției de ATP, activarea semnalelor apoptotice (eliberarea citocromului c) și lipotoxicitate (apoptoza indusă de ceramidă) (Boudina și Abel, 2010).

Pentru a evalua dacă lipsa observată a efectelor depinde de doza utilizată, am triplat cantitatea de MSC administrată. Cu toate acestea, nu s-a observat niciun efect suplimentar. Nu am testat o doză mai mare, deoarece numărul de celule deja administrate (8 x 106) era deja în limita superioară a celor testate în prezent în studiile clinice (1-10 x 106) (Elnakish și colab., 2012).

Un studiu anterior a descris un efect benefic al administrării MSC asupra șobolanilor diabetici induși de streptozotocină (Zhang și colab., 2008). În timp ce MSC exogen a promovat angiogeneza și remodelarea cardiacă atenuată, nu au fost raportate rezultate funcționale. Acest scurt raport este primul studiu realizat de atunci pentru a descrie efectul MSC asupra cardiomiopatiei diabetice induse de obezitate la nivel funcțional. Arătăm că, în condițiile testate (cale, timp și doze), donatorul MSC are efect neutru asupra cardiomiopatiei diabetice indusă de obezitate.

Ar trebui efectuate studii suplimentare pentru a îmbunătăți efectul putativ al MSC asupra disfuncției cardiace a șoarecilor obezi, cum ar fi precondiționarea MSC, pentru a le mări homing-ul și/sau rezistența la micro-medii de stres oxidativ (Samper și colab., 2012) și alte căi de administrare, cum ar fi intramiocardic sau intracoronar (Elnakish și colab., 2012; Mathiasen și colab., 2012).

MULȚUMIRI

Această lucrare a fost susținută de grantul FONDECYT nr. 11090114 către SDC.

REFERINȚE

ABEL ED, LITWIN SE ȘI SWEENEY G (2008). Remodelarea cardiacă în obezitate. Physiol Rev 88, 389-419. [Link-uri]

ANKRUM J și KARP JM (2010). Terapia cu celule stem mezenchimale: doi pași înainte, un pas înapoi. Tendințe Mol Med 16, 203-209. [Link-uri]

ASGHAR O, AL-SUNNI A, KHAVANDI K, KHAVANDI A, Withers S, GREENSTEIN A, HEAGERTY AM ȘI MALIK RA (2009). Cardiomiopatia diabetică. Clin Sci (Londra) 116, 741-760. [Link-uri]

BERNARDI S, SEVERINI GM, ZAULI G ȘI SECCHIERO P (2012). Terapii bazate pe celule pentru complicațiile diabetice. Exp Diabetes Res 2012, 872505. [Legături]

BONORA E, KIECHL S, WILLEIT J, OBERHOLLENZER F, EGGER G, BONADONNA RC ȘI MUGGEO M (2003). Sindrom metabolic: epidemiologie și descriere fenotipică mai extinsă. Date transversale din Studiul Bruneck. Int J Obes Relat Metab Disord 27, 1283-1289. [Link-uri]

BOUDINA S ȘI ABEL ED (2010). Cardiomiopatia diabetică, cauze și efecte. Rev. Endocr Metab Disord 11, 31-39. [Link-uri]

CALLIGARIS S, LECANDA M, SOLIS F, EZQUER M, GUTIÉRREZ J, BRANDAN E, LEIVA A, SOBREVIA L ȘI CONGET P (2013a). Șoarecii pe termen lung, alimentația cu conținut ridicat de grăsimi recapitulează 1 modificări cardiovasculare umane: un model animal pentru a studia fazele timpurii ale cardiomiopatiei diabetice. Plus unu (admis) [Link-uri]

CALLIGARIS S, RICCA M ȘI CONGET P (2013b). Test de stres cardiac indus de dobutamină și monitorizat prin cateterizare cardiacă la șoareci. Jurnal de experimente vizualizate 72, 1-6. [Link-uri]

CONGET PA ȘI MINGUELL JJ (1999). Proprietățile fenotipice și funcționale ale celulelor progenitoare mezenchimale ale măduvei osoase umane. J Cell Physiol 181, 67-73. [Link-uri]

DANIELS A, VAN BILSEN M, JANSSEN BJ, BROUNS AE, CLEUTJENS JP, ROEMEN TH, SCHAART G, VAN DER VELDEN J, VAN DER VUSSE GJ ȘI VAN NIEUWENHOVEN FA (2010). Rezerva funcțională cardiacă afectată la șoarecii diabetici de tip 2 db/db este asociată cu remodelare metabolică, dar nu structurală. Acta Physiol (Oxf) 200, 11-22. [Link-uri]

DOMINICI M, LE BLANC K, MUELLER I, SLAPER-CORTENBACH I, MARINI F, KRAUSE D, DEANS R, KEATING A, PROCKOP D ȘI HORWITZ E (2006). Criterii minime pentru definirea celulelor stromale mezenchimale multipotente. Declarația de poziție a Societății internaționale pentru terapie celulară. Citoterapie 8, 315-317. [Link-uri]

ELNAKISH MT, HASSAN F, DAKHLALLAH D, MARSH CB, ALHAIDER IA ȘI KHAN M (2012). Celule stem mezenchimale pentru regenerarea cardiacă: transpunerea în realitate la pat. Celule stem Int 2012, 646038. [Link-uri]

EZQUER FE, EZQUER ME, PARRAU DB, CARPIO D, YANEZ AJ ȘI CONGET PA (2008). Administrarea sistemică a celulelor stromale mezenchimale multipotente inversează hiperglicemia și previne nefropatia la șoarecii diabetici de tip 1. Transplant de măduvă sanguină Biol 14, 631-640. [Link-uri]

EZQUER M, EZQUER F, RICCA M, ALLERS C ȘI CONGET P (2011). Administrarea intravenoasă de celule stromale multipotente previne apariția steatohepatitei nealcoolice la șoarecii obezi cu sindrom metabolic. J Hepatol 55, 1112-1120. [Link-uri]

HAIDAR YM ȘI COSMAN BC (2011). Epidemiologia obezității. Clin Colon Rectal Surg 24, 205-210. [Link-uri]

JONES DA, CHOUDRY F ȘI MATHUR A (2012). Terapia celulară în bolile cardiovasculare: revistele societății naționale prezintă cercetări selectate care au condus progresele recente în cardiologia clinică. Inima 98, 1626-1631. [Link-uri]

KAJSTURA J, FIORDALISO F, ANDREOLI AM, LI B, CHIMENTI S, MEDOW MS, LIMANA F, NADAL-GINARD B, LERI A ȘI ANVERSA P (2001). Supraexpresia IGF-1 inhibă dezvoltarea cardiomiopatiei diabetice și a stresului oxidativ mediat de angiotensină II. Diabet 50, 1414-1424. [Link-uri]

LORENZ JN ȘI ROBBINS J (1997). Măsurarea presiunii intraventriculare și a performanței cardiace la șoarece anesteziat cu piept închis intact. Sunt J Physiol 272, H1137-1146. [Link-uri]

MATHIASEN AB, JORGENSEN E, QAYYUM AA, HAACK-SORENSEN M, EKBLOND A și KASTRUP J (2012). Raționamentul și proiectarea primului studiu randomizat, dublu-orb, controlat cu placebo, al injecției intramiocardice a celulelor stromale mezenchimale derivate din măduva osoasă autologă în insuficiența cardiacă ischemică cronică (MSC-HF Trial). Am Heart J. 164, 285-291. [Link-uri]

MIKI T, YUDA S, KOUZU H ȘI MIURA T (2013). Cardiomiopatia diabetică: fiziopatologie și caracteristici clinice. Heart Fail Rev 18, 149-166. [Link-uri]

OBUNAI K, JANI S ȘI DANGAS GD (2007). Morbiditatea și mortalitatea cardiovasculară a sindromului metabolic. Cu Clin North Am 91, 1169-1184, x. [Link-uri]

RUBLER S, DLUGASH J, YUCEOGLU YZ, KUMRAL T, BRANWOOD AW ȘI GRISHMAN A (1972). Nou tip de cardiomiopatie asociată cu glomeruloscleroza diabetică. Sunt J Cardiol 30, 595-602. [Link-uri]

SAMPER E, DIEZ-JUAN A, MONTERO JA ȘI SEPULVEDA P (2012). Terapia cu celule cardiace: stimularea efectelor celulelor stem mezenchimale. Stem Cell Rev. [Link-uri]

SUNG JH, YANG HM, PARK JB, CHOI GS, JOH JW, KWON CH, CHUN JM, LEE SK ȘI KIM SJ (2008). Izolarea și caracterizarea celulelor stem mezenchimale de șoarece. Transplant Proc 40, 2649-2654. [Link-uri]

VALLE-PRIETO A ȘI CONGET PA (2010). Celulele stem mezenchimale umane gestionează eficient stresul oxidativ. Stem Cells Dev 19, 1885-1893. [Link-uri]

VAN LINTHOUT S, STAMM C, SCHULTHEISS HP ȘI TSCHOPE C (2011). Celulele stem mezenchimale și cardiomiopatia inflamatorie: homing cardiac și nu numai. Cardiol Res Pract 2011, 757154. [Link-uri]

ZHANG N, LI J, LUO R, JIANG J ȘI WANG JA (2008). Celulele stem mezenchimale ale măduvei osoase induc angiogeneza și atenuează remodelarea cardiomiopatiei diabetice. Exp Clin Endocrinol Diabet 116, 104-111. [Link-uri]

Autor corespondent: Sebastián D. Calligaris, dr. Instituto de Ciencias, Facultatea de Medicină, Clínica Alemana, Universidad del Desarrollo, Santiago, Chile. Adresa: Av. Las Condes 12.438, Lo Barnechea. Telefon: 56 2 23279682 - fax: 56 2 23279693 - E-mail: [email protected]

Primit: 8 aprilie 2013. În formă revizuită: 5 iulie 2013. Acceptat: 23 iulie 2013.

Tot conținutul acestei reviste, cu excepția cazurilor în care este identificat, este o licență Creative Commons

Canada 253, piso 3º, Dpto. F.

Tel.: (56-2) 22093503

Fax: (56-2) 22258427


[email protected]