Conceptualizare roluri, curatare date, analiză formală, investigație, metodologie, administrare proiect, resurse, validare, vizualizare, scriere - schiță originală, scriere - revizuire și editare

anguilliformes

Afiliere Institutul Național de Cercetare în Știința Pescuitului, Agenția Japoneză pentru Cercetare și Educație în domeniul Pescuitului, Kanazawa, Yokohama, Japonia

Roluri Conceptualizare, Investigație, Metodologie, Scriere - schiță originală, Scriere - recenzie și editare

Afilieri Institutul Național de Cercetare în Știința Pescuitului, Agenția Japoneză de Cercetare și Educație în domeniul Pescuitului, Kanazawa, Yokohama, Japonia, Institutul de Cercetare inginerie civilă pentru regiunea rece, Institutul de cercetare a lucrărilor publice, Sapporo, Hokkaido, Japonia

Roluri Arhivarea datelor, Resurse, Scriere - revizuire și editare

Afiliere Institutul Național de Cercetare în Știința Pescuitului, Agenția Japoneză pentru Cercetare și Educație în domeniul Pescuitului, Kanazawa, Yokohama, Japonia

Roluri Achiziție finanțare, administrare proiect

Afiliere Institutul Național de Cercetare în Știința Pescuitului, Agenția Japoneză pentru Cercetare și Educație în domeniul Pescuitului, Kanazawa, Yokohama, Japonia

Roluri Arhivarea datelor, analiză formală, investigație

Afiliere Institutul Național de Cercetare în Știința Pescuitului, Agenția Japoneză pentru Cercetare și Educație în domeniul Pescuitului, Kanazawa, Yokohama, Japonia

Investigarea rolurilor, resurse

Afiliere Institutul Național de Cercetare în Știința Pescuitului, Agenția Japoneză pentru Cercetare și Educație în domeniul Pescuitului, Kanazawa, Yokohama, Japonia

Afilierea Institutului de Cercetare în Acvacultură, Universitatea Kindai, Higashimuro, Wakayama, Japonia

Roluri Achiziție finanțare, investigație, administrare proiect

Afiliere Tohoku Institutul Național de Cercetare în domeniul Pescuitului, Agenția Japoneză de Cercetare și Educație în domeniul Pescuitului, Shiogama, Miyagi, Japonia

Roluri Curarea datelor, Analiza formală

Afiliere RIKEN Center for Sustainable Resource Science, Tsurumi, Yokohama, Japonia

Roluri Arhivarea datelor, Analiza formală, Scriere - revizuire și editare

Afiliere RIKEN Center for Sustainable Resource Science, Tsurumi, Yokohama, Japonia

Investigații de roluri, scriere - recenzie și editare

Afișare Stația Shibushi, Institutul Național de Cercetare în Acvacultură, Agenția Japoneză de Cercetare și Educație în domeniul Pescuitului, Shibushi, Kagoshima, Japonia

Roluri Arhivarea datelor, analiză formală, validare, vizualizare, scriere - revizuire și editare

Afiliere Institutul Național de Cercetare în Știința Pescuitului, Agenția Japoneză pentru Cercetare și Educație în domeniul Pescuitului, Kanazawa, Yokohama, Japonia

  • Chow-ul tău,
  • Nobuharu Inaba,
  • Satoshi Nagai,
  • Hiroaki Kurogi,
  • Yoji Nakamura,
  • Takashi Yanagimoto,
  • Hideki Tanaka,
  • Daisuke Hasegawa,
  • Taiga Asakura,
  • Jun Kikuchi

Cifre

Abstract

Citare: Chow S, Inaba N, Nagai S, Kurogi H, Nakamura Y, Yanagimoto T și colab. (2019) Analiza dietei moleculare a larvelor Anguilliformes leptocephalus colectate în vestul Pacificului de Nord. PLoS ONE 14 (11): e0225610. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225610

Editor: Rachel S. Poretsky, Universitatea din Illinois la Chicago, STATELE UNITE

Primit: 10 iulie 2019; Admis: 7 noiembrie 2019; Publicat: 27 noiembrie 2019

Disponibilitatea datelor: Toate datele secvenței sunt disponibile la LC439371 - LC439410, LC464077 - LC464098, LC474264 - LC474368.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de subvenții din cadrul Proiectului instituției de avansare a cercetării tehnologice bio-orientate, NARO (proiectul schemei speciale privind cercetarea și dezvoltarea avansată pentru tehnologia de generație următoare) către DH.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Analizele moleculare au fost folosite recent pentru a determina conținutul intestinal al leptocefalilor. Deși secvențe de ADNr 18S dintr-o mare varietate de organisme planctonice au fost detectate din intestinul anghilei europene (A. anguilla) leptocefalii, zooplanctonul gelatinos (meduza hidrozoană) a fost suspectat a fi dieta principală [12]. Cu toate acestea, nu s-a găsit ADN ribozomal animal (distanțier transcris intern 1) în probele intestinale de leptocefali japonezi de anghilă, iar materialul deja degradat a fost suspectat în dietă [13]. Recent, a fost aplicată o analiză metagenomică mai avansată care utilizează secvențierea generației următoare (NGS), relevând că 76% din citirile ADNr 18S recuperate din intestinul leptocefalului anghilelor europene aparțin filumului Cnidaria [14]. Cu toate acestea, consumul de meduze cnidare este în contradicție cu rezultatele analizei stabile a izotopilor, în care pozițiile trofice ale leptocefalilor au fost raportate a fi scăzute [6,15-19]. O problemă inerentă în studiile moleculare anterioare [12-14] este că nu a fost analizat niciun specimen de pe suprafața corpului leptocefalilor, care ar putea fi o sursă majoră de contaminare încrucișată.

Am efectuat analize metagenomice bazate pe rADN 18S folosind NGS nu numai pentru probele de conținut intestinal, ci și pentru probele de răzuire a suprafeței corpului leptocefalilor, în care rNNA 18S cnidari din probele de răzuire a suprafeței corpului au predominat asupra celor din probele de conținut intestinal.

Materiale și metode

Declarație de etică

Eșantioanele larvare capturate cu plase de plancton desfășurate de pe navele de cercetare au fost moarte la preluare și prelevate în acest moment, iar toate operațiunile cu plasă de plancton au fost efectuate în marea liberă în afara Zonei Economice exclusive. Prin urmare, aprobarea statelor de coastă nu era necesară în temeiul Convenției Națiunilor Unite privind dreptul mării (UNCLOS).

Prelevarea și identificarea leptocefalică

Acidul nucleotidic peptidic (PNA) a îndreptat prinderea PCR

Am adoptat clemarea PCR în direcția PNA pentru a inhiba selectiv amplificarea rDNA 18S gazdă [13,22]. O sondă PNA a fost concepută pentru a se anexa la secvența din apropierea regiunii 5 ’în gena ARNr 18S, iar secvența nucleotidică a fost NH2-ACGGCCGGTACAGTG-CONH2 având 80,7 ° C Tm. Versatilitatea unei perechi de grund pentru ADNr 18S menționată mai sus a fost testată utilizând o gamă largă de eucariote: anghilă japoneză (A. japonica), pufferfish japonez (Takifugu rubripes), arboret japonez (Sardinops melanostictus), ghimpe cu bandă largă (Sebastolobus macrochir), Pacific ton roșu (Thunnus orientalis), creveți de apă dulce (Palaemon paucidens), homar spini (Panulirus penicillatus), arici de mare (Diadema setosum), macroalge brune (Sargassum horneri și Petalonia binghamiae), diatom (Pha) (Ceratoperidinium), în care s-a observat amplificarea unei dimensiuni preconizate a fragmentului (cca 550 pb) la toate speciile. Eficiența prinderii PCR a fost testată prin adăugarea de 1 μL PNA (10 μM) la 25 μL de amestec de reacție PCR folosind probe de eucariote menționate mai sus. O strângere eficientă a fost observată la anghila japoneză, la capul spinos cu bandă largă și la tonul roșu al Pacificului, în timp ce nu s-a observat nicio inhibare aparentă a amplificării la celelalte organisme.

Analiza genetică a probelor GC și BSS ale leptocefalilor

Un control PhiX ADN spike-in a fost amestecat cu biblioteca de ADN colectat pentru a îmbunătăți calitatea datelor eșantioanelor cu diversitate scăzută, cum ar fi ampliconi PCR unici. Concentrațiile de ADN din biblioteca colectată și ADN-ul PhiX au fost ajustate la 4 nM folosind tampon EB (10 mM Tris-HCI pH 8,5) amestecat la un raport de 7: 3,5 μL. Biblioteca de 4 nM a fost denaturată cu 5 pl de NaOH 0,1 N proaspăt. Folosind tamponul HT1 (furnizat de kitul de reactivi Illumina MiSeq v. 2 pentru 2 × 150 bp PE), biblioteca denaturată (10 μL; 2 nM) a fost diluată la o concentrație finală de 12 pM pentru secvențierea pe platforma MiSeq.

Procese de tratare a datelor MPSS și preluarea unității taxonomice operaționale

Secvențele nucleotidice au fost demultiplexate pe baza etichetei 5'-multiplex identificator (MID) și a secvențelor de exemplu folosind formatul implicit în MiSeq. Secvențele care conțin cleme de palindrom mai lungi de 30 bp și homopolimer mai lung de 9 bp au fost tăiate din secvențe la ambele capete. Cozile de 3 'cu un scor mediu de calitate mai mic de 30 la sfârșitul ultimei ferestre de 25 bp au fost, de asemenea, tăiate din fiecare secvență. Cozile de 5 'și 3' cu un scor mediu de calitate din Tabelul 1. Rezumatul probelor de leptocefalie colectate în 2017 și utilizate în acest studiu.

Prezentare generală a grupurilor eucariote în probele GC și BSS

Eșantionul GC a fost obținut din 36 de leptocefali, deoarece stoarcerea GC a eșuat în patru eșantioane (Tabelul 1). Proba BSS a fost colectată din 17 leptocefali (Tabelul 1). Dintre OTU obținute după verificarea calității pentru secvențe de ADNr 18S, cele cu similaritate scăzută (Tabelul 2. Rezumatul grupurilor eucariote detectate în conținutul intestinal (GC) și probele de răzuire a suprafeței corpului (BSS) de leptocefali de anghilă, și numărul de OTU și citiri de ADNr 18S.

Opt grupuri eucariote detectate în probele GC cuprindeau 75 OTU și 103464 citiri și șapte grupuri eucariote detectate în probele BSS cuprindeau 64 OTU și 97612 citiri (Tabelul 2, Fig. 1A și 1B). Meduza a fost componenta principală în ambele probe, ocupând 33,0% din totalul citirilor în probele GC și 67,5% în probele BSS. Parazitul conoid a fost al doilea cel mai abundent contribuitor (23,8%) în eșantionul GC, dar zero în eșantionul BSS. Grupurile eucariote mai puțin frecvente în probele GC și BSS au fost tunicate (10,1% și, respectiv, 14,0%), copepod (11,1% și 2,7%), kril (3,9% și 7,9%), anelide (Fig. 1. Compoziția celor opt grupuri eucariote (vezi Tabelul 2) detectate în probele intestinului și a suprafeței corpului de Anguilliformes leptocephali.

(A) Prezentare generală a celor opt grupuri eucariote din probele intestinale (n = 35). (B) Prezentare generală a celor șapte grupuri eucariote din probele de suprafață corporală (n = 16). (C) Compoziția celor opt grupuri eucariote din fiecare leptocefalie.

Compoziții eucariote în fiecare probă

Compoziția eucariotă a variat considerabil între indivizii leptocefali (Fig. 1C). Un indice de diversitate Shannon-Wiener a variat între 0 și 0,814 în probele GC și între 0 și 0,699 în probele BSS, fără nicio diferență semnificativă între probe (Mann (testul Whitney U, p = 0,578), dar eterogenitatea între GC și BSS probele menționate mai sus au fost, de asemenea, la nivel individual (Fig. 1C). Diferența sistematică în compozițiile eucariote între probele GC și BSS a fost ilustrată folosind analiza PCA (Fig 2). Probele GC au fost dispersate indiferent de specie (Fig 2, simboluri negre). Pe de altă parte, probele de BSS au fost strâns legate între ele (Fig. 2, simboluri galbene), cu excepția a trei valori exterioare (Fig. 2, săgeată), în care nu s-a observat citirea meduzei în aceste trei probe de BSS (vezi și Fig. 1C, Aj -664S, Am-612S și SR-614S).

Analiza componentelor principale ale compozițiilor eucariote 18S rADN din conținutul intestinului (simboluri negre) și probe de răzuire a suprafeței corpului (simboluri galbene). Cercuri (Anguilla japonica și A. marmorata), triunghiuri (Gymnothorax spp.), Diamante (Robinsia sp.) Și pătrate (alte specii). Săgețile indică trei valori exterioare în suprafața corpului care răzuiesc probele fără citire cnidariană.

Citirile meduzelor au fost detectate în 18 din 35 de probe GC și 13 din 16 probe BSS cu diferență semnificativă (testul exact Fisher, p = 0,040), iar numărul de citiri standardizate al meduzelor a fost mai mare în probele BSS decât în ​​probele GC (Mann –Testul Whitney U, p Fig 3. Compoziția taxonilor meduzei cnidari depistate în conținutul intestinal (G) și probele de răzuire a suprafeței corpului (B) din 13 leptocefali având atât probele G, cât și B.

Numărul de citiri de secvențe din eșantion a fost convertit în număr de citiri relative la un milion de citiri.

Discuţie