Bibliotecă NCBI. Un serviciu al Bibliotecii Naționale de Medicină, Institutele Naționale de Sănătate.

hemoglobinei

Old J, Harteveld CL, Traeger-Synodinos J, și colab. Prevenirea talasemiilor și a altor tulburări ale hemoglobinei: Volumul 2: Protocoale de laborator [Internet]. Ediția a II-a. Nicosia (Cipru): Federația Internațională Talasemie; 2012.

Prevenirea talasemiilor și a altor tulburări ale hemoglobinei: Volumul 2: Protocoale de laborator [Internet]. Ediția a II-a.

3.1. METODE CROMATOGRAFICE (PENTRU DETERMINAREA HbA2)

Determinarea cantitativă a HbA2 este cel mai valoros test pentru identificarea purtătorului β-talasemiei. Au fost stabilite mai multe metode, dar doar câteva sunt recomandate acum pentru acuratețea lor. Trebuie subliniat faptul că precizia și acuratețea determinării HbA2 utilizând scanarea densitometriei după electroforeza cu acetat de celuloză nu este satisfăcătoare și utilizarea sa trebuie evitată (1). Focalizarea isoelectrică (IEF) are o rezoluție excelentă care permite o cuantificare precisă, dar este greoaie și consumă mult timp. Electroforeza capilară (CE) este utilizată tot mai mult într-un cadru de diagnostic clinic pentru diagnosticarea hemoglobinopatiilor. Mai multe studii au arătat o corelație excelentă între electroforeza capilară și cromatografia cu schimb de cationi de înaltă performanță (HPLC) pentru analiza calitativă și cantitativă a hemoglobinei (2-4).

Cele mai utilizate metode pentru măsurarea HbA2 sunt CE, HPLC și mai rar microcromatografia pe DE-52 (5-8). Aceste metode sunt foarte precise, rapide și simple. În plus, CE și HPLC identifică și măsoară multe variante de hemoglobine, inclusiv variantele frecvent întâlnite HbS, HbC, HbE și Hb D-Punjab. Figura 3.1 prezintă exemple de cromatograme HPLC de la 4 analizoare diferite (Variant II, HA 8160, G7 și Ultra 2) în comparație cu CE.

FIG. 3.1

Exemple de cromatograme HPLC în comparație cu CE (adaptat de la van Delft și colab. 2009 ref 4). De la stânga la dreapta: Capilare CE, Varianta II, HA 8160, G7 și Ultra 2. a = normal; b = HbA/S; c = HbA/C; d = HbA/E; e = HbA/D; f = β-talasemie heterozigotă HbA2 ridicată. (Mai mult.)

3.1.1. HPLC PENTRU PROIECTAREA EMOGLOBINOPATIILOR

Cation: schimbul de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) a apărut ca metodă de alegere pentru cuantificarea HbA2, HbF și pentru detectarea și cuantificarea variantelor de Hb, în ​​special cele care pot interacționa cu β-talasemia, cum ar fi HbS, E, C, O -Arab, D și Lepore.

Principiu: În această metodă tampoane fosfat la concentrații diferite (fază mobilă), trec sub presiune printr-o coloană de schimb ionic (fază staționară). Faza staționară constă dintr-un cartuș analitic cu temperatură controlată care conține o rășină de particule anionice sau cationice (3-5 μm). Stația cromatografică oferă un gradient tampon programat de creștere a forței ionice și a pH-ului către cartuș prin două pompe cu dublu piston, iar hemoglobinele sunt separate în funcție de interacțiunea lor ionică cu faza staționară.

Hemoglobinele separate trec apoi prin celula de curgere a fotometrului filtrului, unde se măsoară modificările absorbantei (415 nm); variațiile de fundal sunt corectate printr-un filtru suplimentar la 690 nm. Fiecare hemoglobină se caracterizează printr-un timp de retenție specific, care este timpul scurs de la injectarea probei până la vârful unui vârf de hemoglobină.

Factorii de calibrare pentru HbA2, F, A1C sunt calculați automat prin procesarea unei probe de calibrare la începutul fiecărei runde. Software-ul specific transformă datele brute colectate din fiecare analiză într-un raport care prezintă cromatograma, cu toate fracțiile de hemoglobină eluate, timpii de retenție, zonele vârfurilor și valorile (%) diferitelor componente ale hemoglobinei. Raportul prezintă procentele de hemoglobine F, A1C, A și A2 și oferă determinarea calitativă și cantitativă a hemoglobinelor anormale.

Probă: Sânge venos în orice anticoagulant.

Metodă: Un aparat utilizat în mod obișnuit este varianta (Laboratoarele Bio-Rad). Cu toate acestea, rezultate fiabile au fost obținute recent și cu alte instrumente, cum ar fi HA816 (Menarini Arkay) și G7 (Tosoh- Bioscience) (4).

Rezultate și interpretare: Intervalul normal așteptat pentru HbA2 este între 1,7% și 3,2% la subiecții normali, în timp ce la purtătorii de β-talasemie când este între 4,0% și 7%. Valorile HbA2 sunt considerate limită atunci când sunt între 3,2% și 3,8%. Eșantioanele cu aceste niveluri necesită investigații suplimentare pentru posibila talasemie normală a HbA2 (vezi Tabelul 1.1). Intervalul normal pentru HbF este de obicei mai mic de 1,5% din hemoglobina totală.

Mașinile HPLC au ferestre de identificare a analitilor care ajută la interpretarea hemoglobinelor normale și anormale detectate în proba de sânge (9). Ferestrele sunt intervale de timp de retenție definite în care sunt eluate variantele comune de hemoglobină (de exemplu, HbS, C și D). Cu toate acestea, trebuie subliniat că, din moment ce alte variante de Hb pot avea un timp de retenție similar cu variantele comune, (Tabelele 3.1a și 3.1b), identificarea variantei de Hb este doar prezumtivă (Figura 3.1) și analiza ADN-ului sau a aminoacizilor de globină este necesar pentru identificarea definitivă a variantei Hb (10). HPLC este, de asemenea, utilizat pentru programe de screening pentru hemoglobinopatie neonatală (11).

Tabelul 3.1a

Timpi de eluare a unor variante de hemoglobină observate cu sistemul HPLC BioRad Variant-II.

Tabelul 3.1 b

(partea 1) Zone de eluție ale unor variante de hemoglobină observate cu sistemul de electroforeză capilară capilară Sebia: Zonele 1-7.