Revizuieste articolul

  • Articol complet
  • Cifre și date
  • Referințe
  • Citații
  • Valori
  • Licențierea
  • Reimprimări și permisiuni
  • PDF

Abstract

Proteinele recombinante au aplicații largi în dezvoltarea compușilor farmaceutici, aplicații industriale ale enzimelor și cercetarea proteomică de bază. În acest fel, producția eficientă de proteine ​​recombinate cu puritate ridicată necesită metode eficiente de purificare. Au fost concepute diverse strategii pentru a îmbunătăți purificarea acestor proteine, cum ar fi purificarea afinității și metodele de purificare fizico-chimice, care purificarea afinității are unele avantaje față de celelalte. Strategiile de afinitate, în special strategiile de fuziune, au fost concepute ca instrumente indispensabile pentru producția masivă paralelă, identificarea și purificarea proteinelor recombinate din sistemele gazdă. Aceste strategii facilitează formulările comerciale și industriale ale proteinelor recombinante, îmbunătățesc studiul interacțiunilor proteice la nivel molecular și dezvoltă bioanalize foarte sensibile și specifice. Recent, diferite nanoparticule modificate la suprafață au fost dezvoltate pe scară largă pentru a îmbunătăți recuperarea și purificarea proteinelor recombinante, cum ar fi nanoparticulele de polimeri hidrofobi și nanoparticulele de oleozină. În această revizuire, ne propunem să discutăm tehnologiile de purificare a afinității și să abordăm principiile, avantajele, limitările și potențialele aplicații ale acestora.

abordări

1. Introducere

Expresia heterologă a proteinelor este un pas necesar pentru studiul funcțiilor biologice ale genelor, dezvoltarea compușilor farmaceutici, aplicațiile industriale ale enzimelor și cercetarea proteomicii de bază. Principalul avantaj al utilizării proteinelor recombinante este că o mulțime de informații sunt adesea deja disponibile despre produs și impuritățile majore, simplificând astfel testele de detectare, metodele de preparare a probelor și strategiile de purificare. Aceste informații permit dezvoltarea rapidă a strategiilor atât pentru producția industrială, cât și pentru cercetare, de ținte specifice de proteine ​​recombinante. Progresele în sistemele de exprimare a proteinelor au permis producția de aproape orice proteină și peptidă dorită, adesea cu randamente ridicate. Cu toate acestea, aceste produse trebuie purificate pentru a permite studiul și aplicarea lor (Banki, Gerngross și Wood, 2005; Healthcare, 2007).

Varietatea diferitelor tehnici de purificare a crescut datorită diferitelor calități și cantități de proteine ​​recombinate necesare în scopuri de cercetare și industriale. Pe de altă parte, randamentele proteinelor recombinate sunt, de asemenea, afectate de condițiile de expresie utilizate. Luată împreună, producția economică de proteine ​​recombinate necesită implementarea unor metode eficiente de purificare, precum și a unor gazde de expresie cu randament ridicat (Healthcare, 2007). Pentru a răspunde acestei nevoi, au fost concepute diverse strategii pentru a îmbunătăți ratele de recuperare a proteinelor recombinante dorite, inclusiv metode de purificare fizico-chimice și metode de purificare a afinității (Kimple, Brill, & Pasker, 2013; Kosobokova, Skrypnik și Kosorukov, 2016; Wingfield, 2015).

Într-o strategie ideală de purificare, ar trebui să existe un echilibru între o serie de parametri care afectează rezultatul final. Acestea includ viteza de purificare, rata de recuperare, capacitatea și rezoluția. Rezoluția se referă la capacitatea tehnicii de a produce vârfuri complet separate (de bază rezolvate). Cu toate acestea, impuritățile cu proprietăți similare proteinei țintă împiedică obținerea rezoluției dorite în fiecare etapă a procesului de purificare. Cantitatea de proteină țintă care poate fi încărcată pe o singură unitate în timpul procesului de purificare este denumită capacitate și poate avea un impact major asupra economiei generale a procesului. Recuperarea reflectă fracția de proteină recombinantă exprimată care este în cele din urmă purificată de contaminanții organismului gazdă. În general, proprietățile fizico-chimice ale probei și nivelul de purificare necesar sunt factorii cei mai influenți care determină strategia finală de purificare (Healthcare, 2007).

Din aceste motive, dezvoltarea unor metode simple, fiabile, scalabile și rapide pentru purificarea proteinelor recombinante rămâne un obiectiv critic pentru noile tehnologii de bioseparare. În special, metodele de platformă care pot fi aplicate cu ușurință noilor ținte proteice cu optimizare minimă sunt atractive. Aceste metode generale pot accelera cercetarea și dezvoltarea de noi produse și pot scurta timpul necesar pentru livrarea comercială.

În ultimii ani, au fost dezvoltate diferite etichete de fuziune pentru a îmbunătăți detectarea sau purificarea proteinelor recombinante, îmbunătățirea solubilității (Loughran & Walls, 2017) și îndepărtarea etichetelor (Arnau, Lauritzen, Petersen și Pedersen, 2006; Young, Britton și Robinson, 2012 ). Este important de menționat că procesul de purificare este facilitat prin fuzionarea proteinelor cu diferite tipuri de etichete; aceste etichete sunt folosite pentru a crește randamentul de exprimare și purificare. De asemenea, acestea sunt aplicate pentru a spori stabilitatea și solubilitatea proteinelor de interes și, de asemenea, pentru a reduce toxicitatea proteinelor recombinante asupra celulei gazdă (Arnau și colab., 2006; Young și colab., 2012).

În ceea ce privește importanța acestor etichete în producția de proteine ​​recombinante, ne propunem să abordăm progresele recente în acest domeniu și să discutăm elementele de bază și caracteristicile diferitelor strategii de afinitate dezvoltate recent.

2. Purificarea afinității

Publicat online:

Figura 1. Construcția de fuziune N-terminal (a) și Construcția de fuziune C-terminal (b). Există două metode pentru etichetele de fuziune la nivelul ADN până la expresia unui protien de fuziune marcat, eticheta poate fi plasată la terminalul N sau terminalul C. Fiecare construcție de fuziune constă dintr-o etichetă de afinitate, o regiune linker care include o secvență specifică pentru scindarea proteazei și proteina țintă.

Figura 1. Construcția de fuziune N-terminal (a) și Construcția de fuziune C-terminal (b). Există două metode pentru etichetele de fuziune la nivelul ADN până la expresia unui protien de fuziune marcat, eticheta poate fi plasată la terminalul N sau terminalul C. Fiecare construcție de fuziune constă dintr-o etichetă de afinitate, o regiune linker care include o secvență specifică pentru scindarea proteazei și proteina țintă.

Proteinele familiei Small ubiquitin-like modificator (SUMO) cu legare covalentă de lanțurile laterale lizinice ale proteinelor țintă au unele roluri în modificările posttranslaționale în celulele eucariote, care sunt importante pentru transportul nuclear, transducția semnalului și stabilizarea proteinelor. De fapt, cu o astfel de legare covalentă ajută la corectarea plierii și solubilității proteinelor țintă în celule. Deci, acest aspect al proteinelor SUMO le-a făcut să fie candidați atrăgători pentru inducerea solubilității și plierea corectă a proteinelor recombinate prin fuziune la N-terminal al proteinelor țintă la nivelul ADN-ului. În plus, conformația SUMO mai ales motivele conservate Gly-Gly au fost recunoscute de o protează SUMO, S. cerevisiae Ulp1, care este o caracteristică importantă pentru purificarea specifică a proteinelor recombinate. Deși această metodă de purificare este un instrument mai eficient la gazdele procariote, gazdele eucariote au un dezavantaj cu această metodă că au în mod natural protează SUMO pentru scindarea etichetei SUMO (Guerrero și colab., 2015; Kimple și colab., 2013; Malakhov și colab. ., 2004; Marblestone și colab., 2006; Panavas, Sanders și Butt, 2009). Deoarece metoda de purificare se bazează pe etichetă, mai degrabă decât pe țintă, aceeași peptidă de fuziune poate fi utilizată pentru purificarea diferitelor tipuri de proteine ​​recombinate pe baza aceleiași metodologii de purificare (Young și colab., 2012). În prezent, etichetele de fuziune pot fi eliminate prin metode chimice (cum ar fi bromură de cianogen sau hidroxilamină) sau metode enzimatice. Metodele chimice sunt oarecum nespecifice și pot provoca denaturarea proteinelor și modificarea lanțului lateral al aminoacizilor în proteine ​​dorite. Cu toate acestea, metodele enzimatice sunt mai specifice și, de obicei, se despart în condiții ușoare. Au fost utilizate mai multe endoproteaze pentru îndepărtarea etichetei, cum ar fi enterokinaza, factorul Xa, proteaza SUMO, proteaza virusului de etch de tutun (TEV), trombina, 3C, Granzyme B și Caspase-6. Printre acestea, enterokinaza, trombina și factorul Xa sunt enzimele cele mai frecvent aplicate în scopul îndepărtării etichetei fără a necesita un aminoacid specific sau o secvență la locul de scindare. Alte strategii enzimatice sunt utilizarea exopeptidazelor. Exopeptidazele constau în aminopeptidaze (cum ar fi aminopeptidaza M, Aeromonasaminopeptidaza) și carboxipeptidaze (cum ar fi carboxipeptidaza A și B) (Arnau și colab., 2006; Yadav și colab., 2016).

2.1. Cromatografia de afinitate

Publicat online:

Figura 2. Schema etapelor implicate în purificarea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. La început, o etichetă specifică este fuzionată pentru a viza proteinele la nivel de ADN pentru a exprima proteina de fuziune marcată, astfel amestecul de proteine ​​este colectat și adăugat la coloana care conține liganzi specifici pentru proteina de interes. Moleculele nedorite sunt spălate și în cele din urmă se adaugă o protează pentru a separa proteina țintă de eticheta de afinitate.

Figura 2. Schema etapelor implicate în purificarea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. La început, o etichetă specifică este fuzionată pentru a viza proteinele la nivel de ADN pentru a exprima proteina de fuziune marcată, astfel amestecul de proteine ​​este colectat și adăugat la coloana care conține liganzi specifici pentru proteina de interes. Moleculele nedorite sunt spălate și în cele din urmă se adaugă o protează pentru a separa proteina țintă de eticheta de afinitate.

2.2. Purificarea tandemă a afinității (TAP)

Publicat online:

Figura 3. Fuziunea cu etichetă de afinitate dublă construiește două etichete de afinitate diferite sunt fuzionate pentru a viza proteina la nivelul ADN pentru a exprima o proteină de fuziune. Fiecare construcție de fuziune constă din două etichete de afinitate (la N-Terminal și C-Terminal), două secvențe specifice pentru scindarea proteazei și proteina țintă.

Figura 3. Fuziunea cu etichetă de afinitate dublă construiește două etichete de afinitate diferite sunt fuzionate pentru a viza proteina la nivelul ADN pentru a exprima o proteină de fuziune. Fiecare construcție de fuziune constă din două etichete de afinitate (la N-Terminal și C-Terminal), două secvențe specifice pentru scindarea proteazei și proteina țintă.

2.3. Precipitații de afinitate

2.3.1. Purificarea ciclului de tranziție inversă (ITC)

Publicat online:

Figura 4. Schema purificării proteinelor recombinante prin polipeptidă asemănătoare elastinei (ELP) Agregarea proteinei de fuziune este declanșată prin creșterea temperaturii soluției și/puterea ionului. După centrifugare (sau filtrare), supernatantul (sau filtratul) cuprinzând moleculele solubile contaminante este în cele din urmă aruncat, proteina țintă este separată de ELP prin scindare prin protează situspecifică la un loc de recunoaștere între proteina țintă și ELP.

Figura 4. Schema purificării proteinelor recombinante prin polipeptidă asemănătoare elastinei (ELP) Agregarea proteinei de fuziune este declanșată prin creșterea temperaturii soluției și/puterea ionului. După centrifugare (sau filtrare), supernatantul (sau filtratul) cuprinzând moleculele solubile contaminante este în cele din urmă aruncat, proteina țintă este separată de ELP prin scindare prin protează situspecifică la un loc de recunoaștere între proteina țintă și ELP.

2.4. Partiționare prin afinitate

2.4.1. Tehnologia de fuziune a hidrofobinei

2.5. Purificare de afinitate auto-clivabilă

Îndepărtarea proteolitică a etichetelor de afinitate este un impediment în extinderea metodei de purificare a afinității datorită posibilei nespecificități a proteazei utilizate, care poate duce la scindarea la situsurile în afara țintei din cadrul proteinei de fuziune. Mai mult, majoritatea reacțiilor de scindare apar la temperaturi ridicate care pot denatura proteina produsă. În plus, este posibil ca site-ul de scindare să nu fie disponibil pentru toate proteinele de fuziune. Recent, etichetele de afinitate auto-clivabile au fost dezvoltate pe baza elementelor proteice auto-îmbinate cunoscute sub numele de inteine ​​care elimină în mod eficient etapa de tratament cu protează a proteinei de fuziune purificate (Shah & Muir, 2014; Wood et al., 2000; Xu & Evans, 2001).

Publicat online:

Figura 5. Purificarea proteinelor recombinante prin nanoparticule PHA și celule de clivaj bazate pe inteină care conțin granule PHB și proteina marcată cu fazină-inteină sunt lizate și centrifugate pentru a separa componentele solubile. Granulele de PHB insolubile cu proteina de fuziune legată de PHB sunt spălate și resuspendate într-un tampon care induce clivajul pentru eliberarea proteinei țintă. O centrifugare finală separă granulele PHB și proteinele asociate de proteina țintă scindată și proteina țintă rămâne în fracția solubilă.

Figura 5. Purificarea proteinelor recombinante prin nanoparticule PHA și celule de clivaj bazate pe inteină care conțin granule PHB și proteina marcată cu fazină-inteină sunt lizate și centrifugate pentru a separa componentele solubile. Granulele insolubile de PHB cu proteina de fuziune legată de PHB sunt spălate și resuspendate într-un tampon care induce scindarea pentru eliberarea proteinei țintă. O centrifugare finală separă granulele PHB și proteinele asociate de proteina țintă scindată și proteina țintă rămâne în fracția solubilă.

2.6. Nanoparticule în separare de afinitate

2.6.1. Nanoparticule de polimer hidrofob

2.6.2. Tehnologia de fuziune a oleozinei