ARTICOLE ORIGINALE

  • Articol complet
  • Cifre și date
  • Referințe
  • Citații
  • Valori
  • Reimprimări și permisiuni
  • PDF

Abstract

Introducere

Aspergiloza aviară este o boală infecțioasă și necontagioasă cauzată de Aspergillus spp. Aceste ciuperci sunt omniprezente și pot fi izolate de sol, aer și vegetație. Cea mai frecvent izolată specie este Aspergillus fumigatus dar altele Aspergillus spp., inclusiv Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus glaucus și Aspergillus nidulans, poate juca, de asemenea, un rol (Okoye & Okeke, 1986; Barton și colab., 1992; Perelman & Kuttin, 1992; de Wit și colab., 1993; Oglesbee, 1997; Joseph, 2000). Ocazional apar infecții mixte (Perelman și Kuttin, 1992).

articolul

A. fumigatus este un agent patogen oportunist, cauzând infecții clinice la o presiune crescută a infecției sau la gazdele imunosupresate. Celulele fagocitare și mecanismele de eliminare microbiană respiratorie normale sunt apărarea de primă linie împotriva sporilor inhalați. Boala apare atunci când acest mecanism defensiv intrapulmonar devine inadecvat și nu reușește să elimine organismul (Oglesbee, 1997).

Materiale și metode

Animale

În primul experiment, 18 porumbei de curse adulți sănătoși din punct de vedere clinic (Columba livia domestica) au fost împărțite în trei grupe de șase porumbei. În cel de-al doilea experiment, 35 de porumbei cu porumbei sănătoși din punct de vedere clinic, de 4 săptămâni până la 5 săptămâni au fost împărțiți în șapte grupe de patru porumbei și un grup de șapte porumbei. Animalele erau libere de Salmonella spp. și endoparaziți. În timpul experimentului, fiecare pasăre a fost adăpostită individual la 20-22 ° C și 31% până la 55% umiditate relativă cu o fotoperioadă de 12 ore. Păsările au primit o dietă comercială cu porumbei ad libitum și avea acces gratuit la apă potabilă proaspătă.

Toate experimentele au fost efectuate cu permisiunea Comitetului Etic al Facultății de Medicină Veterinară, Merelbeke, Universitatea din Gent, Belgia (CE 2006/099).

Inocul experimental

A. fumigatus tulpina utilizată în acest studiu a fost izolată dintr-un porumbel de curse, care pierdea în greutate timp de 4 săptămâni și a prezentat dispnee severă. Culturile vechi de cinci zile ale acestei tulpini pe Sabouraud dextroză agar (CM0041; Oxoid Ltd, Basingstoke, Marea Britanie) au fost spălate cu 5 ml de 0,01% Tween 80 în soluția de sare echilibrată a Hank (HBSS) pentru recoltare A. fumigatus conidia. Conidiile au fost spălate de trei ori în 0,01% Tween 80 în HBSS (3200 x g, 10 min la 4 ° C) și suspensia a fost ajustată la o concentrație de 10 6 sau 10 8 A. fumigatus conidii/ml în HBSS prin număr de hemacitometre.

Proiectare experimentală

Primul experiment a fost efectuat pentru a determina o doză adecvată de infecție. Trei grupe de șase porumbei au fost inoculate intratraheal, fie cu 0,2 ml de 10 6 sau 10 8 A. fumigatus conidia/ml suspensie în HBSS sau cu 0,2 ml HBSS. Al doilea experiment a fost efectuat pentru a examina impactul utilizării diferitelor căi de inoculare și imunosupresie asupra evoluției unei infecții cu A. fumigatus. Șapte grupuri de patru porumbei au fost inoculate fie cu 0,2 ml de 10 8 A. fumigatus conidia/ml suspensie în HBSS (grupe 4, 5, 6, 7 și 8) sau cu 0,2 ml HBSS (grupuri de control 1 și 2) utilizând una dintre următoarele căi de inoculare: intratraheală (grupa 8), inoculare în aerul toracic drept sac (grupurile 1, 4 și 6) și inoculare în partea apicală a plămânului drept (grupurile 2, 5 și 7). Porumbeii din trei grupuri au primit trei injecții cu dexametazonă (2 mg/kg intramuscular la fiecare 48 de ore) înainte de inoculare cu A. fumigatus (Grupurile 6, 7 și 8). Un grup de porumbei (n= 7) au primit doar trei injecții cu dexametazonă (grupul de control 3).

Animalele au fost observate cel puțin de două ori pe zi. Prezența unor pene ciufulite, dispnee, strănut și stridor au fost marcate orbește. Din considerente etice, porumbeii cu dispnee severă (respirație cu cioc deschis) sau slăbiciune extremă au fost eutanasiați. Acest lucru a fost notat ca „mortalitate”. În primul experiment la 22 de zile după inoculare (p.i.) și în al doilea experiment la 7 zile p.i., toți porumbeii rămași au fost eutanasiați printr-o injecție intravenoasă de 0,2 ml T61 (Intervet, Mechelen, Belgia) în vena bazilicii. La necropsie, au fost descrise leziuni macroscopice și s-au recoltat probe pentru examen micologic și bacteriologic.

Greutate

Toți porumbeii au fost cântăriți în momentul primei injecții cu dexametazonă, în momentul inoculării și la necropsie. Analiza statistică a fost efectuată folosind un eșantion de două t test (Microsoft Office Excel).

Scorul clinic

În fiecare zi, fiecărui porumbel i s-a acordat un scor pentru sărituri la coadă și respirație abdominală. Aceste scoruri au variat de la 0 la 1 (0 = absent, 0,2 = abia vizibil, 0,4 = ușor, 0,6 = moderat, 0,8 = pronunțat, 1 = foarte pronunțat). Suma celor două scoruri formează scorul dispneei pentru un anumit porumbel într-o anumită zi. Prezența sau absența penelor ciufulite, ca semn general al bolii, a fost, de asemenea, observată zilnic pentru fiecare porumbel.

Examenul micologic și bacteriologic

În primul experiment, probe de trahee, plămâni și saci de aer, iar în al doilea experiment, probe de trahee, plămâni, saci de aer, inimă, pericard, ficat, rinichi, creier, mușchi pectoral și lichid abdominal, au fost inoculate pe dextroza Sabouraud. plăci de agar și incubate la 37 ° C în condiții aerobe pentru a le izola A. fumigatus. Creșterea A. fumigatus a fost evaluat la 2 zile după inocularea plăcii. Examenul bacteriologic a fost efectuat pe ficatul tuturor porumbeilor utilizând tehnici standard de izolare microbiologică.

Polimorfism de lungime microsatelit

Polimorfismul lungimii microsateliților (MLP) a fost utilizat pentru a confirma că micozele în timpul acestui studiu provin din tulpina inoculată.

ADN-ul a fost extras prin următoarea tehnică. Pentru fiecare izolat, o bucată de miceliu a fost decupată de pe placa de agar. După topirea agarului, miceliul a fost zdrobit manual pentru a elibera ADN din celule. După centrifugare (16 100 x g, 2,5 min), supernatantul a fost utilizat pentru reacția în lanț a polimerazei.

Amorsele au fost selectate pentru amplificarea microsateliților A, B, C și D (Tabelul 1). Un exemplu per set a fost marcat cu colorant fluorescent 6-carboxifluoresceină pentru detectare cu un secvențiator automat de ADN. Amplificarea PCR a fost efectuată într-un volum de 20 μl conținând 1,5 mM MgCl2, 100 μM dNTPs, 0,1 μM pentru fiecare primer, 0,025 U/μl Taq ADN polimerază și 2 μl supernatant. Amplificarea a fost efectuată într-un sistem Eppendorf ® Mastercycler ep, cu denaturare timp de 5 minute la 94 ° C, 35 cicluri de timp de 30 sec la 94 ° C, 30 sec la 59 ° C și 30 sec la 72 ° C și un final pas de extensie la 72 ° C timp de 30 min. Doi microlitri ai produsului PCR au fost amestecați cu 12 formamidă deionizată și 0,3 pl rox 500LIZ. Acest amestec a fost denaturat la 95 ° C timp de 2 minute și incubat pe gheață timp de 0,5 ore. Probele au fost analizate în continuare prin electroforeză capilară (ABI 3100; Applied Biosystems). O tulpină de referință (CBS 143.89; Centraal Bureau voor Schimmelculturen, Utrecht, Olanda) a fost inclusă în toate analizele ca un control intern.

Publicat online:

Tabelul 1. Exemplu de secvențe pentru multiplicarea microsateliților A, B, C și D (Bart-Delabesse și colab., 1998)

Rezultate

Semne clinice

Porumbeii imunocompetenți inoculați intratraheal nu au prezentat semne clinice în primul experiment.

În al doilea experiment, o diferență semnificativă (Modelare P Aspergillus fumigatus infecții la porumbei de curse (Columba livia domestica)

Publicat online:

Tabelul 2. Pierderea totală medie în greutate ca procent din greutatea inițială la porumbei, fie inoculați cu A. fumigatus sau fals inoculat, la 7 zile p.i. (sau la eutanasie)

Publicat online:

Tabelul 3. Scorurile clinice medii zilnice pentru dispnee și prezența sau absența penelor zburlite pe zi la porumbei, fie inoculați cu A. fumigatus sau fals inoculat

Mortalitate

În primul experiment, nu a fost observată mortalitate în niciun grup. În al doilea experiment, nu s-a observat mortalitate în grupurile martor negative, cu excepția a doi din șapte porumbei din grupa 3 (tratați cu dexametazona, neinoculați), care au murit din cauza unei Streptococcus gallolyticus septicemie. Mortalitatea în A. fumigatus-grupurile inoculate au variat între 1/4 și 4/4, cea mai scăzută mortalitate apărând în grupurile 5 și 8 (inoculate în plămâni; și tratate cu dexametazonă, inoculate în trahee) și mortalitate de 100% în grupurile 4, 6 și 7 ( inoculat în sacul de aer; tratat cu dexametazonă, inoculat în sacul de aer; și tratat cu dexametazonă, inoculat în plămâni). Mortalitatea a fost mai acută în grupurile 4, 6 și 7 (inoculate în sacul de aer; tratate cu dexametazonă, inoculate în sacul de aer; și tratate cu dexametazonă, inoculate în plămâni), decât în ​​grupurile 5 și 8 (inoculate în plămâni; și tratat cu dexametazonă, inoculat în trahee) (Tabelul 4).

Publicat online:

Tabelul 4. Mortalitatea zilnică la porumbei, fie inoculați cu A. fumigatus sau fals inoculat

Descoperiri patologice

Porumbeii imunocompetenți inoculați intratraheal nu au prezentat leziuni macroscopice la necropsie.

În cel de-al doilea experiment, nu s-au observat leziuni în grupurile martor, cu excepția a doi din șapte porumbei din grupa 3 (tratați cu dexametazonă, neinoculați) care au murit de S. gallolyticus septicemie. La acești porumbei, s-a observat un aspect palid al ficatului și al mușchiului pectoral. Constatările patologice ale A. fumigatus-porumbeii inoculați sunt rezumați în Tabelul 5. Necropsie a arătat leziuni sugestive de aspergiloză la toate A. fumigatus-grupe de porumbei inoculați. Cele mai pronunțate leziuni au fost observate în tractul respirator și în organele viscerale. Leziunile sacului aerian au inclus prezența focarelor granulomatoase și înnorarea. Leziunile pulmonare au inclus prezența focarelor granulomatoase și hemoragice. Leziunile de pe pericard au inclus prezența focarelor granulomatoase și un conținut de lichid galben. Leziunile hepatice au inclus focare granulomatoase și congestie. Un aspect palid al rinichilor, o concentrare granulomatoasă mare în creier și prezența unui aspect palid și focare granulomatoase pe mușchii pectorali au fost de asemenea observate ocazional.

Publicat online:

Tabelul 5. Descoperiri patologice și micologice la porumbeii inoculați cu A. fumigatus

Constatări micologice

În primul experiment, A. fumigatus nu a putut fi izolat de trahee, plămâni și saci de aer ai oricărui porumbei.

În al doilea experiment, A. fumigatus a fost izolat din diferite organe ale tuturor porumbeilor inoculați și nu a putut fi izolat din organele non-A. fumigaţie-porumbei inoculați (Tabelul 5).

Polimorfism de lungime microsatelit

Toate tulpinile izolate au avut aceleași caracteristici MLP ca tulpina inoculată (A123B102C167D112), cu excepția unei tulpini (A127B161C165D78). Această tulpină a fost izolată din rinichii palizi ai unui porumbel din grupa 7 (tratat cu dexametazonă, inoculat în partea apicală a plămânului drept). Tulpina izolată din traheea aceluiași porumbel a avut aceleași caracteristici MLP ca tulpina inoculată.

Discuţie

Porumbeii adulți imunocompetenți inoculați intratraheal nu au prezentat semne clinice, mortalitate sau leziuni la necropsie. A. fumigatus nu a putut fi izolat de trahee sau alte organe ale acestor animale. Aparent, porumbeii au fost capabili să elimine infecția chiar și la doze foarte mari de infecție. Această constatare sugerează că porumbeii sănătoși din punct de vedere clinic nu sunt predispuși să dezvolte aspergiloză. Această susceptibilitate scăzută ar putea fi dependentă de specii (Chaudhary și Sadana, 1988; Femenia și colab., 2007) și dependent de vârstă (O'Meara & Chute, 1959; Femenia și colab., 2007). Prin urmare, în al doilea experiment au fost folosiți porumbei de porumbei (vechi de 4 până la 5 săptămâni).

Pe baza rezultatelor noastre, propunem inocularea de A. fumigatus în partea apicală a plămânului drept folosind porumbei imunocompetenți ca model preferat de aspergiloză cronică. Inoculând A. fumigatus în sacul aerian toracic drept al porumbeilor imunocompetenți pare a fi cel mai bun model pentru aspergiloză acută.