Neurodegenerare

Editat de
Rafael Linden

Universitatea Federală din Rio de Janeiro, Brazilia

Revizuite de
Cristina Banuelos

National Institute on Aging, National Institutes of Health (NIH), Statele Unite

Rudimar L. Frozza

Fundația Oswaldo Cruz (Fiocruz), Brazilia

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

caracteristici

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Laborator de mecanisme moleculare de îmbătrânire, Institutul Federal de Cercetare al Institutului de Citologie și Genetică, filiala siberiană a Academiei Ruse de Științe (SB RAS), Novosibirsk, Rusia
  • 2 Laboratorul mecanismelor centrale de reglementare, Institutul de biologie moleculară și biofizică, Centrul federal de cercetare în medicină fundamentală și translațională, Novosibirsk, Rusia

Introducere

Materiale și metode

Animale

Șobolanii OXYS accelerați la senescență și șobolanii Wistar cu vârsta potrivită au fost obținuți din Laboratorul de animale experimentale de reproducere al Institutului de Citologie și Genetică, SB RAS, Novosibirsk, Rusia. Tulpina OXYS a fost derivată din tulpina Wistar de șobolani de la Institutul de Citologie și Genetică așa cum s-a descris anterior (Stefanova și colab., 2010) și a fost înregistrată în baza de date a genomului șobolanului. 1 În acest moment, avem a 112-a generație de șobolani OXYS, cu cataractă în curs de dezvoltare spontană și sindrom de senescență accelerată moștenit într-o manieră legată. Animalele au fost ținute în condiții standard de laborator (22 ° C ± 2 ° C, 60% umiditate relativă și 12 h lumină/12 h ciclu întunecat) și au avut ad libitum acces la furaje standard pentru rozătoare (PK-120-1, Laboratorsnab, Ltd., Rusia) și apă.

Parametrii de reproducere și datele materne

Șobolani femele de 3 luni naivi sexual (n = 20 per grup) au fost cântărite și apoi împerecheate cu bărbați cu vârsta potrivită. Sarcina a fost identificată prin prezența spermatozoizilor în frotiurile vaginale în dimineața următoare, care a fost desemnată ziua gestațională 0. Am evaluat durata gestației, dimensiunea așternutului și raportul de sex al puilor, precum și greutatea corporală, greutatea creierului și raportul greutate creier-corp [semnificație (greutatea creierului ÷ greutatea corporală) × 100%] a puilor de sex masculin în ziua 0 postnatală (PND0), PND10, PND14, PND20 și PND45.

Testarea comportamentală

Am evaluat activitatea locomotorie și anxietatea șobolanilor masculi prin testul în câmp deschis și testul cu labirint ridicat plus. Fiecare test a fost efectuat o dată pe animal. Sesiunile de testare au fost programate între orele 10 a.m. și 2 p.m.

Testul în câmp deschis

Testul a fost efectuat pentru a estima activitatea locomotorie și exploratorie a șobolanilor OXYS și Wistar la PND20 și PND45 (n = 20 pe grup). Zona în câmp deschis a constat dintr-o arenă pătrată închisă din Plexiglas opac (100 × 100 cm) înconjurat de ziduri (40 cm înălțime). Arena a fost împărțită prin linii transversale în 100 de pătrate egale. O zonă centrală a fost definită în mod arbitrar ca un pătrat de 40 × 40 cm. O sursă de lumină centrală (100 W) de pe tavan a oferit iluminare invariantă într-o cameră altfel întunecată. Fiecare șobolan a fost plasat în același colț al arenei orientat în aceeași direcție și i s-a permis să exploreze în mod liber arena timp de 300 de secunde. De fiecare dată când ambele membre posterioare intrau într-un pătrat, se înregistra o traversare. Activitățile locomotorii și exploratorii au fost evaluate prin numărarea traversărilor de linie și apoi convertirea acestui parametru la distanța trecută, precum și prin numărarea evenimentelor de creștere (când un animal stătea pe membrele posterioare). În plus, anxietatea a fost evaluată prin înregistrarea timpului înainte de prima intrare în zona centrală. Se presupunea că un șobolan se află în zona centrală atunci când cele patru membre erau pe el. A fost determinat și numărul acțiunilor de auto-îngrijire.

Pentru a evalua activitatea locomotorie a șobolanilor OXYS și Wistar la PND10 și PND14 (n = 20 per grup), am modificat arena câmpului deschis, precum și durata fiecărei sesiuni în conformitate cu Shimomura și Ohta (1988). Zona consta dintr-o arenă dreptunghiulară închisă (20 × 30 cm) împărțită prin linii transversale în 24 de pătrate egale (5 × 5 cm). Fiecărui animal i s-a permis să exploreze în mod liber arena timp de 150 de secunde. S-a determinat distanța parcursă, numărul de ascensoare anterioare și numărul de auto-îngrijiri.

Testul Labirint Elevated Plus

Anxietatea șobolanilor OXYS și Wistar la PND45 (n = 20 per grup) a fost estimată utilizând testul de labirint ridicat plus. Aparatul de labirint plus a fost realizat din Plexiglas opac și conținea două brațe deschise opuse (50 × 10 cm) și două brațe închise de aceeași dimensiune, dar cu pereți înalți de 40 cm. Fiecare braț a fost împărțit prin linii în cinci pătrate egale (10 × 10 cm). Aparatul a fost ridicat la 50 cm deasupra podelei. Fiecare șobolan a fost plasat în pătratul central al labirintului plus, cu fața către unul dintre brațele închise, iar comportamentul acestuia a fost analizat timp de 300 de secunde. Pentru a analiza comportamentul animalelor în testul cu labirint ridicat plus, am înregistrat criteriile descrise de Rodgers și Dalvi (1997).

Pregătirea țesuturilor

Animalele au fost eutanasiate prin asfixiere cu CO2 și decapitate; creierele au fost îndepărtate cu grijă și emisferele au fost separate. Pentru un test imunohistochimic, emisfera dreaptă a fost fixată imediat în paraformaldehidă 4% în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) la temperatura camerei (RT) timp de 48 de ore urmată de crioprotecție în zaharoză 30% în PBS la 4 ° C timp de 48 de ore. Apoi, creierele au fost înghețate și depozitate la -70 ° C până la prelucrarea ulterioară.

Imunohistochimie

Vizualizarea fibrelor cu mușchi

Hipocampii au fost excizați din creierul șobolanilor OXYS și Wistar la PND0, PND10, PND14, PND21 și PND45 (n = 6 până la 8 animale pe genotip și vârstă), tăiate transversal la o grosime de 400 μm și fixate în paraformaldehidă 4% la + 4 ° C timp de 24 de ore. În cea mai mare parte, au fost analizate feliile din părțile dorsale și medii ale hipocampului. Pentru a evalua caracteristicile morfologice ale fibrelor de mușchi, cristalele de 1,1′-dioctadecil-3,3,3 ′, 3′-tetrametilindocarbocianină perclorat (DiI; Molecular Probes, Statele Unite) au fost diluate într-un amestec de dimetil sulfoxid și etanol (2: 1); apoi soluția rezultată (2 mg/ml) a fost injectată în zona DG a feliilor de hipocamp. Feliile au fost incubate în PBS timp de 7 zile necesare pentru răspândirea colorantului de la somate neuronale la axoni. Pentru a dezvălui straturile celulare, feliile au fost colorate suplimentar cu colorare Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, Statele Unite) la 3 μg/ml timp de 20 de ore. Analiza a fost efectuată la microscop confocal (LSM-780-NLO, Zeiss, Germania) la Centrul Multi-Acces pentru Microscopia Obiectelor Biologice (Institutul de Citologie și Genetică, SB RAS, Novosibirsk, Rusia). Măsurătorile morfometrice au fost efectuate în software microscopic standard pe proiecții z a cinci imagini confocale consecutive ale fiecărei felii, de obicei la o adâncime de 15-25 μm.

Figura 1 prezintă pozițiile straturilor de celule (DG și CA3), ale fasciculului suprapiramidal (SPB) și ale fasciculului infrapiramidal (IPB), precum și locurile de injectare DiI. Modificările dependente de vârstă ale mărimii feliei au fost evaluate ca o distanță între punctele maxim îndepărtate ale stratului de celule granulare și neuronii piramidali ai CA3 (L); lungimile relative ale IPB și SPB au fost calculate ca rapoarte IPB/L și SPB/L. Lățimea fasciculelor a fost măsurată în zona în care fasciculele părăsesc hilul. Lățimea stratului piramidal a fost evaluată în funcție de localizarea nucleelor ​​celulelor piramidale colorate în zona adiacentă hilului.

figura 1. (A) Ilustrație schematică a localizării fibrelor de mușchi într-o secțiune transversală a hipocampului șobolan. DG: girus dentat, sp: strat piramidal, CA3: zona hipocampală CA3, H: hilus, SPB și IPB: mănunchiuri suprapiramidale și infrapiramidale de fibre mușchii, DiI: locuri de injectare a 1,1′-dioctadecil-3,3,3 ′ 3'-tetrametilindocarbocianină perclorat, L: distanța maximă între DG și CA3 utilizată pentru determinarea dimensiunii feliei. (B) Imagine reprezentativă a hipocampului șobolanului OXYS la PND10. DiI (roșu) etichetează fibrele cu mușchi; Hoechst (albastru) indică nucleele celulare. Bara de scară este de 200 μm.

Statistici

Datele au fost supuse unei analize bidirecționale a varianței (ANOVA) în software-ul Statistica 8.0 (StatSoft, Statele Unite). Genotipul, vârsta și sexul au fost alese ca variabile independente. The Newman - Keuls post hoc testul a fost aplicat efectelor principale și interacțiunilor semnificative pentru a evalua diferențele dintre unele seturi de mijloace. Datele au fost prezentate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Diferențele au fost considerate semnificative statistic la p # p 0,05). Absența unei scăderi a timpului înainte de prima intrare în zona centrală la șobolanii OXYS împreună cu o creștere semnificativă a distanței parcurse de la PND20 la PND45 poate indica anxietate crescută a șobolanilor OXYS la PND45.

Luate împreună, aceste rezultate au însemnat o creștere semnificativă a activității locomotorii la șobolani de la PND10 la PND45. Cu toate acestea, la vârste mai tinere, activitatea locomotorie nu a diferit între șobolanii OXYS și Wistar, dar am observat o activitate locomotorie semnificativ mai mică la șobolanii OXYS decât la șobolanii Wistar la PND20 și PND45. Mai mult, am observat semne de anxietate crescută la șobolanii OXYS la PND45; prin urmare, în continuare, am analizat anxietatea șobolanilor Wistar și OXYS la PND45 prin testul de labirint ridicat plus.

Nivelul de anxietate la PND45 în testul Labirint Plus Plus

Numărul de intrări în brațele deschise și pătratele încrucișate în ele de șobolanii OXYS la PND45 au fost de 1,5 și de 2 ori mai mici în comparație cu șobolanii Wistar egali cu vârsta (p # p # p 0,05), și astfel acest parametru a devenit mai mare față de șobolanii Wistar (p # p Cuvinte cheie: boala Alzheimer, dezvoltare postnatală, îmbătrânire, hipocamp, neurogeneză, fibre de mușchi hipocampice, șobolani OXYS

Citare: Rudnitskaya EA, Kozlova TA, Burnyasheva AO, Tarasova AE, Pankova TM, Starostina MV, Stefanova NA și Kolosova NG (2020) Caracteristici ale dezvoltării hipocampale postnatale într-un model de șobolan al bolii Alzheimer sporadice. Față. Neuroști. 14: 533. doi: 10.3389/fnins.2020.00533

Primit: 04 decembrie 2019; Acceptat: 29 aprilie 2020;
Publicat: 05 iunie 2020.

Rafael Linden, Universitatea Federală din Rio de Janeiro, Brazilia

Rudimar Luiz Frozza, Fundația Oswaldo Cruz (Fiocruz), Brazilia
Cristina Banuelos, Institutul Național pentru Îmbătrânire, Institutele Naționale de Sănătate (NIH), Statele Unite