Departamentul de Afiliere pentru Toxicologie de Mediu, Institutul de Mediu și Sănătate Umană, Texas Tech University, Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, Texas, Statele Unite ale Americii

greutatea

Departamentul de Afiliere pentru Toxicologie de Mediu, Institutul de Mediu și Sănătate Umană, Texas Tech University, Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, Texas, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru patologie, Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, Texas, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Afiliere pentru Toxicologie de Mediu, Institutul de Mediu și Sănătate Umană, Texas Tech University, Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, Texas, Statele Unite ale Americii

  • Chuanwen Lu,
  • Wenbin Zhu,
  • Chwan-Li Shen,
  • Weimin Gao

Cifre

Abstract

Citare: Lu C, Zhu W, Shen C-L, Gao W (2012) Polifenolii de ceai verde reduc greutatea corporală la șobolani prin modularea genelor legate de obezitate. PLoS ONE 7 (6): e38332. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038332

Editor: Marcia B. Aguila, Universitatea de Stat din Rio de Janeiro, Centrul Biomedical, Institutul de Biologie, Brazilia

Primit: 10 martie 2012; Admis: 3 mai 2012; Publicat: 8 iunie 2012

Finanțarea: Acest studiu a fost parțial susținut de Institutul Laura W. Bush pentru Sănătatea Femeii și Spitalul Universitar Winthrop. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Peste două treimi dintre adulții din Statele Unite sunt supraponderali sau obezi și peste o treime din S.U.A. adulții sunt obezi [1]. Prevalența obezității crește rapid în multe țări, astfel încât obezitatea este văzută ca o pandemie globală. Consecințele acestui fapt nu sunt numai efectele sociale și psihologice ale greutății excesive, ci și morbiditatea semnificativă și mortalitatea prematură asociate cu afecțiunile medicale grave la care predispune obezitatea, inclusiv diabetul de tip II, hipertensiunea arterială, boala coronariană și diferite forme de cancer [2], [3].

S-a recunoscut că mulți factori de risc, cum ar fi aportul caloric crescut, consumul redus de energie, echilibrul energetic influențat de sistemul nervos central, termogeneza adaptativă, neuropeptidele și neurotransmițătorii, contribuie la obezitate [4]. Rolul interacțiunilor dintre factorii de mediu și genetici în contribuția la obezitatea poligenică complexă și obezitatea comună a fost mai important deoarece nu există în prezent un tratament eficient, în afară de intervenția chirurgicală majoră [5]. Prin urmare, prin descoperirea unor gene noi sau a unor noi căi etiologice, pot fi găsite și/sau utilizate în studiile obezității terapii inovatoare, măsuri preventive și strategii farmacogenetice.

Materiale și metode

Animale și tratamente GTP

Șobolani femele Virgin Sprague Dawley (SD) (n = 36, în vârstă de 3 luni, Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, SUA) au fost găzduiți într-o unitate de îngrijire a animalelor controlată de mediu și aclimatizați timp de 5 zile pe o dietă AIN-93M și apă distilată ad libitum înainte de începerea experimentelor. Dietele s-au bazat pe o modificare a dietei AIN-93M și au fost furnizate de Research Diets Inc. (New Brunswick, NJ, SUA). Aceeași cantitate de minerale și vitamine a fost dată tuturor animalelor.

Izolarea ARN-ului total

Șobolanii (în vârstă de 11 luni) au fost anesteziați și eutanasiați (fără post), iar probele de ficat au fost colectate la sfârșitul experimentului. ARN-ul total a fost izolat din probe de ficat din grupurile martor, HF și HF + GTP folosind un mini kit RNeasy® plus (Qiagen, Valencia, CA) urmând protocolul producătorului, așa cum este descris în studiul nostru anterior [23]. Pe scurt, proba de ficat lizat a fost omogenizată, ADN genomic îndepărtat și purificat. ARN-ul a fost eluat cu 30 pl apă fără RNază și stocat la -80 ° C până la utilizare. ARN-ul total extras a fost determinat prin măsurarea DO la 260 nm folosind un spectrofotometru Nano-Drop 1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA). Calitatea și puritatea ARN-ului total au fost evaluate prin electroforeză pe gel de agaroză folosind Horizon 11.14 (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Eșantioanele totale de ARN utilizate pentru experimentele RT - PCR au avut o integritate bună și au avut rapoarte OD A260/A280 între 1.99-2.08 și concentrație ≥45 µg/mL. Eșantioanele totale de ARN au fost tratate în continuare cu ADN-free ™ DNase (Applied Biosystems, Austin, TX) pentru a elimina posibila contaminare a ADN-ului. Au fost analizate trei replici, fiecare dintre care a fost colectat eșantion de la 3 șobolani individuali din fiecare grup (9 șobolani în total), pentru fiecare grup de control, HF și HF + GTP.

Transcriere inversă-PCR

ADNc a fost preparat folosind un set de cabluri pentru matricea RT 2 PCR (SABiosciences Corporation, Frederick, MD) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, 1 µg de ARN total a fost amestecat cu 2 µL de 5 × gDNA tampon de eliminare pentru a forma un volum total de 10 µL amestec de eliminare ADN genomic cu H2O fără RNază, incubat la 42 ° C timp de 5 minute și răcit imediat pe gheață . Amestecul a fost apoi incubat cu un cocktail RTL 10 RTL la 42 ° C timp de 15 minute și reacția a fost oprită prin încălzire la 95 ° C timp de 5 min pentru a inactiva transcriptaza inversă. Amestecul de reacție de sinteză a ADNc de 20 uL a fost diluat la 111 uL adăugând 91 uL H2O fără RNază și păstrat pe gheață pentru utilizare ulterioară.

SYBR® Green RT-PCR pe bază de matrice

(A) Gruparea funcțională a genelor în 3 culori: gene orexigenice în roșu, gene anorectice în galben și gene implicate în consumul de energie în verde. (B) Valoarea CT a controlului calității a utilizat ADN genomic de șobolan.

Analiza IL-1β și IL-6

Probele de ser au fost colectate de la șobolani (11 luni) la sfârșitul experimentului. Citokinele serice proinflamatorii IL-1β și IL-6 au fost analizate de către Bio-Plex ™ Rat Cytokine Panel (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, SUA) cu Luminex 100 Analyzer (Luminex Corporation, Austin, TX) în urma producătorului instrucțiune.

Western Blot

Analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie ± eroare standard (SE), dacă nu se specifică. Datele privind greutatea corporală au fost analizate printr-o analiză unidirecțională a varianței (ANOVA) cu măsuri repetate urmate de teste post-hoc pentru diferența cea mai semnificativă protejată de Fisher (Fisher’s LSD) pentru evaluarea efectelor timpului și tratamentului. Datele de la RT-PCR au fost cuantificate de software-ul de detectare a secvenței ABI și normalizate de 5 gene de menaj (control endogen). ΔCT a fost definită ca valoarea scăderii valorii CT a controlului endogen din valoarea CT a ARN-ului mesager țintă (ARNm). Modificarea pliurilor între grupuri ar putea fi obținută prin ΔΔCT. Valoarea P mai mică de 0,05 pe baza testului t a fost utilizată ca criteriu pentru determinarea genelor exprimate diferențial. Datele de la biomarkeri serici au fost analizate prin ANOVA unidirecțional, urmate de teste post-hoc Fisher’s LSD pentru a evalua efectele tratamentului. Pentru nivelurile de exprimare a proteinelor printre grupurile de control, HF și HF + GTP, au fost utilizate teste ANOVA unidirecționale și post-hoc ale lui Tukey pentru a compara intensitatea densitometrică a probelor individuale între grupuri. Toate analizele au fost efectuate utilizând software-ul SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL, SUA) și diferențele cu P grupul HF + GTP = grupul de control.

Greutatea corporală (g) a șobolanilor martori, HF și HF + GTP tratați la 0-8 luni. Valorile sunt medii (n = 10-12) cu eroarea lor standard (SE) reprezentată de bare verticale. * P Figura 3. Modificările genelor legate de obezitate în rândul grupurilor de control, HF și HF + GTP.

(A) Tabelele genetice reprezentative ale matricii PCR ale genelor nedetectate și ale genelor detectate. (B) Harta de căldură care demonstrează datele de exprimare a reglării pliurilor între grupul HF și grupul de control. Genele cu diferențe semnificative între cele două grupuri sunt prezentate în histogramă. (C) Harta de căldură care demonstrează datele de expresie a reglării pliurilor între grupul HF + GTP și grupul HF. Genele cu diferențe semnificative între cele două grupuri sunt prezentate în histogramă. (D) Harta de căldură care demonstrează datele de exprimare a reglării pliurilor între grupul HF + GTP și grupul de control. Genele cu diferențe semnificative între cele două grupuri sunt prezentate în histogramă.

Analiza sângelui

Nivelurile serice ale IL-1β și IL-6 în grupurile martor, HF și HF + GTP sunt prezentate în Figura 4. În comparație cu grupul martor sau grupul HF + GTP, grupul HF a avut cel mai mare IL- seric. Concentrațiile de 1β și IL-6 în timp ce grupul HF + GTP a avut cele mai mici concentrații serice de IL-1β și IL-6. În comparație cu grupul HF, suplimentarea GTP de 4 luni la dieta HF (grupul HF + GTP) a cauzat o scădere semnificativă a citokinelor serice proinflamatorii, inclusiv IL-1β și IL-6 (P Figura 4. Citokinele proinflamatorii se modifică în rândul martorului, Grupurile HF și HF + GTP.

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SE. # P Figura 5. Analizele Western blot ale expresiei proteinelor în grupurile martor, HF și HF + GTP.

(A) Efectele tratamentului HF și HF + GTP asupra expresiei proteinelor SOD1. (B) Efectele tratamentului HF și HF + GTP asupra expresiei proteinelor COMT. Bloturile au fost, de asemenea, testate pentru α-tubulină pentru a confirma încărcarea egală a proteinelor. Intensitățile relative ale proteinelor SOD1 și COMT au fost comparate cu intensitatea α-tubulinei. Intensitatea fiecărei benzi a fost cuantificată utilizând software-ul Quantity One. Datele sunt mijloace ± SE, n = 3. Experimentele au fost efectuate în trei exemplare. * P grupul HF + GTP (27,78 ± 0,79) = grupul de control (25,78 ± 0,76). În concordanță cu alte rapoarte de modele de obezitate [27], [28], șobolanii obezi, care urmează o dietă IC, rezultând o creștere semnificativă a procentului de masă grasă indică faptul că diferența de greutate corporală se datorează în principal creșterii masei grase.

În prezentul studiu, am arătat că un număr de gene implicate în obezitate s-au schimbat la șobolanii tratați cu HF, ceea ce a demonstrat în continuare utilitatea acestui model de șobolan. În plus, rezultatele noastre au arătat greutatea redusă și controlată datorită activității anti-obezitate a suplimentării cu GTP. Acest efect benefic ar putea fi rezultatul alterării induse de GTP a genelor legate de obezitate, a activității anti-inflamatorii, a capacității de stres anti-oxidativ, precum și a acțiunilor asemănătoare estrogenilor care la rândul lor reglează apetitul, metabolismul sau absorbția caloriilor.

Un total de 12 gene legate de obezitate au prezentat modificări semnificative la șobolanii obezi tratați cu HF în comparație cu cei de la control. Dintre acestea, Adcyap1r1, Adrb1, Agrp, Apoa4, Cntfr, Ghr, Ghrl, Ins1, Lepr, Nr3c1 și Sort1 au scăzut semnificativ, în timp ce IL-1β a crescut semnificativ în grupul HF în comparație cu cele din grupul de control. Există dovezi considerabile că aceste gene joacă trei roluri critice în patogeneza obezității, inclusiv funcția orexigenă, funcția anorectică și cheltuielile de energie.

Agrp, Ghrl și Nr3c1 sunt clasificate ca gene orexigenice. Agrp este unul dintre cei mai puternici și de lungă durată dintre stimulatorii apetitului [29], [30]. Efectele stimulatoare ale poftei de mâncare ale Agrp sunt inhibate de hormonul leptină (mai mare în grupul HF decât grupul martor, date neprezentate) și activate de hormonul grelină (Ghrl, mai scăzut în grupul HF decât grupul martor). Grelina (Ghrl) este ligandul endogen pentru receptorul secretagog al hormonului de creștere (GHSR) pentru menținerea eliberării hormonului de creștere (GH) și a homeostaziei energetice [31]. Studiile anterioare au demonstrat scăderea nivelului de grelină circulantă la om cu obezitate [32], [33]. În mod similar, Nr3c1, gena receptorului glucocorticoidului, a fost raportată a fi implicată în hiperinsulinemie, depunere de grăsime și răspunsuri inflamatorii asociate cu obezitatea [34]. De asemenea, s-a raportat că nivelurile de ARNm Nr3c1 au scăzut semnificativ în ceea ce privește obezitatea [35], [36].

Adcyap1r1 și Adrb1 sunt cele două gene care se referă la cheltuielile de energie. Adcyap1r1 poate influența controlul homeostaziei energetice și are o acțiune antiinflamatoare remarcabilă [54], [55]. Adrb1 induce lipoliza în țesutul adipos [56]. În total, nivelurile modificate ale expresiei a 12 gene de obezitate din grupul HF, în comparație cu grupul de control, sugerează un model obez calificat, care ar putea duce la obezitatea inversată prin reglarea expresiei genelor legate de obezitate. Modelul obezității utilizat în studiul nostru poate simula mai îndeaproape apariția obezității la om, mai degrabă decât modificarea genetică sau modele de obezitate induse de mutație.

Constatările conform cărora suplimentarea GTP în apa potabilă a inversat nivelurile de expresie ale genelor 11/12 (cu excepția Nr3c1) la șobolanii obezi confirmă rolul anti-obezitate al GTP. De exemplu, constatările noastre privind creșterea Adcyap1r1 și Adrb1 după tratamentul GTP sunt în acord cu studiile, demonstrând că ceaiul verde crește cheltuielile de energie [57], [58], [59] și s-a dovedit eficient în reducerea grăsimii corporale parțial mediată prin Adrb1 activare [60].

Inflamația sistemică cronică contribuie direct la dezvoltarea obezității [5], [54] - [57]. De exemplu, femeile supraponderale și obeze au, în general, niveluri serice ridicate de citokine inflamatorii, cum ar fi IL-6 și TNF-α [61], [62], [63]. Prin urmare, suprimarea inflamației cronice poate fi o strategie bună pentru prevenirea și/sau tratarea obezității. Observațiile că grupul HF a crescut expresia genei IL-1β este de acord cu Matsuki și colab. că IL-1β este dăunătoare pentru homeostazia energetică a organismului prin rolul său în metabolismul lipidic prin reglarea nivelului de insulină [64]. Suplimentarea cu GTP a suprimat inflamația cronică datorată unei diete bogate în grăsimi în prezentul studiu, după cum se arată prin scăderea expresiei genei IL-1β și a nivelurilor circulante de IL-1β și IL-6, precum și expresia crescută a genei IL-6rα și Inl1. Cu toate acestea, deși au fost observate niveluri mai mari de exprimare a IL-1β și IL-6 în ser de la șobolanii din grupul HF comparativ cu cele ale martorului, aceste diferențe nu au atins semnificație statistică. Acest lucru s-ar putea datora variațiilor mari din cadrul grupurilor. Prin urmare, sunt necesare studii viitoare care utilizează o dimensiune mai mare a eșantionului.

Una dintre celelalte caracteristici ale obezității cele mai recunoscute este stresul oxidativ crescut [65]. GTP și-a arătat activitățile sale anti-oxidante, rezultând din capacitatea sa de a elimina speciile reactive de oxigen [66]. În prezentul studiu, suplimentarea cu GTP a crescut expresia SOD1 (un indicator al capacității antioxidante) la șobolanii obezi. Rezultatele noastre sunt în concordanță cu rolul anti-obezitate al GTP prin creșterea capacității antioxidante și/sau scăderea daunelor provocate de stresul oxidativ, care se observă frecvent la obezitate [20], [24], [67], [68], [69].

Deși nu a existat o diferență semnificativă statistic în expresia proteinei COMT între grupul HF + GTP și grupul HF datorită variației mari, această restaurare a COMT nu a avut nicio semnificație statistică între grupurile HF + GTP și grupul de control. Activitatea COMT este importantă în reglarea grăsimilor, deoarece proliferarea și diferențierea preadipocitelor pot fi inhibate de 2-metoxiestradiol, a cărui sinteză este catalizată de COMT [70]. Pierderea în greutate are ca rezultat o reducere a estrogenilor circulanți [71], [72]. Prin urmare, restaurarea expresiei COMT observată după tratamentul cu GTP ar inhiba activarea estrogenului prin catalizarea metilării estrogenilor catecolici la metoxi estrogeni mai puțin activi (de exemplu, 2-metoxiestradiol). Mai mult, COMT s-a dovedit a fi implicat în comportamente motivate de recompensă, cum ar fi dezvoltarea obezității induse de dietă prin metabolizarea dopaminei [73]. Luată împreună, pierderea în greutate indusă de GTP poate rezulta posibil și parțial din creșterea COMT prin reglarea estrogenului și a apetitului.

Dintre toate cele 84 de gene legate de obezitate, un total de 35 de gene nu au fost detectate în toate cele 3 grupe de probe de ficat de șobolan. Ar putea exista motive ca genele să nu fie exprimate (sau foarte slab) în țesuturile hepatice, de exemplu Brs3, care este exprimat în mod normal în creier, rinichi și testicul. Calcr se exprimă în mod normal în creier și rinichi. Cartpt poate fi detectat la nivelul creierului, măduvei spinării, prostatei și testiculului, dar nu și la nivelul ficatului [74]; iar sensibilitatea de detectare a matricei genetice este limitată. Pe de altă parte, datorită amestecului de tipuri de celule din probele de țesut, este posibil ca amploarea modificărilor expresiei unor gene să nu fie detectată.

Pe scurt, datele noastre au demonstrat că suplimentarea cu GTP are efecte puternice asupra greutății corporale la șobolanii femele de vârstă mijlocie obezi prin reglarea genelor legate de obezitate, a activității anti-inflamatorii, a capacității de stres anti-oxidativ, precum și a acțiunilor asociate estrogenului. Credem că studiul nostru prezintă un prim pas critic către evaluarea efectelor consumului de ceai verde la femeile obeze de vârstă mijlocie. Cercetările translaționale bazate pe constatări din observațiile la animale pentru a investiga posibila eficacitate terapeutică a GTP la femeile obeze vor fi demne într-un studiu viitor.

informatii justificative

Tabelul S1.

Efectele IC asupra nivelurilor de expresie ale genelor legate de obezitate în comparație cu martorul.