Kiseko Shionoya

Departamentul de Zoologie, Universitatea din Oklahoma, Norman, Oklahoma 73019, SUA

Stephanie Moriceau

Departamentul de Zoologie, Universitatea din Oklahoma, Norman, Oklahoma 73019, SUA

Lauren Lunday

Departamentul de Zoologie, Universitatea din Oklahoma, Norman, Oklahoma 73019, SUA

Cathrine Miner

Departamentul de Zoologie, Universitatea din Oklahoma, Norman, Oklahoma 73019, SUA

Tania L. Roth

Departamentul de Zoologie, Universitatea din Oklahoma, Norman, Oklahoma 73019, SUA

Regina M. Sullivan

Departamentul de Zoologie, Universitatea din Oklahoma, Norman, Oklahoma 73019, SUA

Abstract

Șobolanii fetali și sugari pot învăța să evite mirosurile asociate cu boli înainte de dezvoltarea zonelor cerebrale care susțin această învățare la adulți, sugerând un circuit alternativ de învățare. Aici începem să documentăm tranziția de la sugar la circuitul neuronal adult care stă la baza învățării evitării mirosului-stare de rău folosind LiCl (0,3 M; 1% din greutatea corporală, ip) și o expunere de 30 de minute la miros de mentă. Grupurile de condiționare au inclus: miros asociat-LiCl, miros asociat-LiCl-Nursing, LiCl și miros-ser fiziologic. Rezultatele au arătat că condiționarea mirosului LiCl asociat a indus o aversiune a mirosului învățat în ziua postnatală (PN) 7, 12 și 23 de pui. Asistența medicală asociată cu miros-LiCl a indus o preferință de miros învățat la puii PN7 și PN12, dar a blocat învățarea la puii PN23. Autoradiografia 14C 2-deoxiglucoză (2-DG) a indicat o activitate olfactivă crescută a bulbilor la puii PN7 și PN12 cu preferință de miros și învățare de evitare. Aversiunea la miros la puii în vârstă de înțărcare (PN23) a dus la creșterea activității amigdalei la puii cu miros-LiCl împerecheați, dar nu dacă alăptau. Astfel, circuitul neuronal care susține aversiunile induse de stare de rău se schimbă asupra dezvoltării, indicând faptul că comportamentele similare învățate la sugari și adulți pot avea circuite neuronale distincte.

Animalele învață rapid să evite gusturile, mirosurile și texturile alimentelor asociate cu stare de rău, iar acest proces de învățare produce aversiuni condiționate de gust și miros (Garcia și colab. 1966, 1974; Batsell și Best 1992, 1993). Această învățare a fost demonstrată la începutul dezvoltării, incluzând atât ziua embrionară (ED), 18 șobolani și șoareci, cu timp de retenție care durează săptămâni (Hennessy și colab. 1976; Haroutunian și Campbell 1979; Smotherman 1982; Stickrod și colab. 1982b; Rudy și Cheatle 1983; Smotherman și Robinson 1985, 1990; Alleva și Calamandrei 1986; Coopersmith și colab. 1986; Molina și colab. 1986; Hoffmann și colab. 1987, 1990; Miller și colab. 1990; Hunt și colab. 1991, 1993; Abate și colab. 2001; Richardson și McNally 2003; Gruest și colab. 2004a). Achiziția de aversiune pentru gust/miros arată câteva diferențe specifice între pui și adulți. În primul rând, alăptarea în timpul achiziției tulbură învățarea aversiunii gustului, deși acest lucru se diminuează pe măsură ce puii se apropie de înțărcare (Martin și Alberts 1979; Gubernick și Alberts 1984; Melcer et al. 1985; Kehoe și Blass 1986). În al doilea rând, spre deosebire de parametrii temporali lungi permiși între miros/gust (stimul condiționat, CS) și boală (stimul necondiționat, SU) în aversiunea la gustul adulților, constrângerile temporale dintre CS și starea de rău care produc SUA pentru învățarea puilor sunt foarte limitat (Rudy și Cheatle 1983; Kraemer și colab. 1988, 1989; Hoffmann și colab. 1990, 1991).

Cu acest studiu, am evaluat dezvoltarea comportamentală și neuronală a învățării miros-stare de rău folosind LiCl, care induce boli la puii mici (Haroutunian și Campbell 1979; Spear și Rudy 1991). A fost explorată și capacitatea asistenței medicale de a întrerupe condiționarea mirosului-LiCl. Am folosit șobolani de la o vârstă de dependență totală de mamă până la o vârstă de independență emergentă la înțărcare. Ne-am concentrat asupra a două zone cerebrale, amigdala, care este implicată în învățarea mirosului-stare de rău a adulților (Bermudez-Rattoni și colab. 1986; Batsell și Blankenship 2002; Holland și Gallagher 2004; Pickens și colab. 2005; Touzani și Sclafani 2005) și bulbul olfactiv, care a fost implicat anterior în aversiunea mirosului infantil și în învățarea preferințelor (Coopersmith și Leon 1984, 1986; Coopersmith și colab. 1986; Woo și Leon, 1987; Wilson și Leon 1988; Sullivan și colab. 1989, 2000; Wilson și Sullivan 1990, 1991, 1992; Sullivan și Wilson 1991; McLean și colab. 1999; Okutani și colab. 1999; Yuan și colab. 2002; Moriceau și Sullivan 2004).

Rezultate

Comportament

Mirosul în prezența bolii LiCl sprijină învățarea mirosului-aversiune pe tot parcursul dezvoltării (Fig. 1), iar aceste rezultate replică lucrările anterioare privind învățarea mirosului-rău la pui (Hennessy și colab. 1976; Haroutunian și Campbell 1979; Smotherman 1982; Stickrod et. 198b; Rudy și Cheatle 1983; Smotherman și Robinson 1985, 1990; Alleva și Calamandrei 1986; Coopersmith și colab. 1986; Molina și colab. 1986; Miller și colab. 1990; Abate și colab. 2001; Richardson și McNally 2003). Similar lucrărilor anterioare, asistența medicală modifică aversiunea indusă de mirosul LiCl la toate vârstele testate și produce o preferință de miros la puii de 7-8 și 12-13 zile, dar blochează învățarea aversiunii la puii PN23 - PN24 (Martin și Alberts 1979; Gubernick și Alberts 1984; Melcer și colab. 1985).

comutator

Numărul mediu de alegeri în ceea ce privește mirosul condiționat în testul Y-labirint în urma mirosului pereche-LiCl, Nursing Paroire miros-LiCl și controlul mirosului salin și a grupelor LiCl în funcție de vârstă. Asteriscurile reprezintă diferențe semnificative (P Figura 1 prezintă performanța în testul Y-labirint și indică faptul că puii cu miros-LiCl împerecheați fără prezența unei mame au învățat o aversiune a mirosului la toate vârstele, iar puii care alăptează au învățat o preferință de miros la cele două vârste mai mici ANOVA a dezvăluit un efect principal al stării de antrenament (F (3,60) = 95,333, P Fig. 2) (Sullivan și Wilson 1991; Wilson și colab. 1991). Nu s-au detectat modificări induse de învățarea bulbilor olfactivi la înțărcare (PN23 - PN24) pui în vârstă, care replică lucrările anterioare cu LiCl pe șobolani înțărcați (Coopersmith și colab. 1986).

Asimilarea relativă a bulbului olfactiv 2-DG în timpul condiționării mirosului-LiCl în funcție de vârstă. Asteriscurile reprezintă diferențe semnificative (P Figura 2 ilustrează absorbția bulbului olfactiv 2-DG la puii PN7 - PN8, PN12 - PN13 și PN23 - PN24 și indică faptul că condiționarea miros-LiCl a indus o absorbție sporită de 2DG în bulbul olfactiv al puilor care învață fie aversiune la miros (împerecheat) sau preferință de miros (pui care alăptează LiCl) la cele două grupe de vârstă mai mici. Nu s-au detectat modificări ale bulbilor olfactivi la martori sau la puii PN23 - PN24 mai în vârstă. ANOVA a dezvăluit un efect principal al stării de antrenament (F (3 ), 60) = 32.313, P Fig. 3) Figura 3 prezintă absorbția 2-DG a amigdalei LiCl miros și indică faptul că condiționarea miros-LiCl a indus o absorbție sporită 2DG în amigdala șobolanilor în vârstă înțărcată (PN23 - PN24), dar nu și la vârste mai mici.PN23 pui care primesc miros împerecheat-LiCl în timpul alăptării (nu a reușit să învețe) au prezentat activitate amigdală similară cu martorii. Nu s-au găsit diferențe statistice pentru niciun nucleu amigdalian la PN7 - PN8 sau PN12 - PN13. Analiza statistică a arătat pui PN23 - PN24 a prezentat o activitate amigdală sporită în th e nuclei bazolaterali, laterali, corticali, mediali și centrali (Basolateral: ANOVA a dezvăluit un efect principal al stării de antrenament [F (3,60) = 7.403, P Fig. 1) (Gubernick și Alberts 1984; Melcer și colab. 1985). Mecanismul pentru acest lucru este neclar, deși presupusa sa semnificație este de a transmite mirosurile/gusturile alimentelor din dieta mamei către pui pentru a spori selecția alimentară ulterioară și consumul de alimente probabil sigure (Bilko și colab. 1994; Galef Jr. 1997; Mennella și colab. . 2001).

S-au arătat alte constrângeri de învățare la șobolanii sugari care sugerează că puii au o capacitate atenuată de a învăța aversiunile la miros și răspunsurile inhibitorii, împiedicând astfel puii să învețe să evite/inhibe răspunsurile la mirosul matern. Într-adevăr, această învățare timpurie a evitării mirosului este în contrast puternic cu frica/evitarea/condiționarea olfactivă olfactivă atenuată, precum și cu lipsa de exprimare a fricii la mirosurile de prădători observate la puii de șobolan nou-născuți (Collier și Mast 1979; Haroutunian și Campbell 1979; Blozovski și Cudennec 1980; Stehouwer și Campbell 1980; Bialik și colab. 1984; Misanin și colab. 1985; Camp și Rudy 1988; Takahashi 1992; Myslivecek 1997; Sullivan și colab. 2000; Wiedenmayer și Barr 2001; Roth și Sullivan 2003, 2005; Moriceau și Sullivan 2004, 2005, 2006; Moriceau și colab. 2004, 2006). Apariția acestor abilități de învățare și frica la mirosul prădătorului coincide cu apariția funcției amigdalei.

Constrângeri suplimentare de învățare devin evidente atunci când mama este prezentă. Mai exact, prezența maternă poate diminua răspunsul puilor la durerea indusă de șoc, așa cum este indicat de un răspuns comportamental scăzut (Richardson și colab. 1989). Durerea livrată în timpul alăptării a crescut latența de evadare, care nu a fost modificată de opioide (Blass și colab. 1995). Alăptarea sau prezența maternă simplă diminuează eliberarea hormonului de stres corticosteron (Stanton și colab. 1987; Moriceau și Sullivan 2006). Capacitatea mamei de a bloca eliberarea de corticosteron indusă de stres are ca rezultat un bloc de condiționare a fricii (miros-0,5mA șoc) și produce o preferință de miros în PN15. Această blocadă maternă a condiționării fricii poate fi anulată cu o perfuzie intraamigdală de CORT (Moriceau și Sullivan 2006). Capacitatea experiențelor legate de legăturile sociale de a schimba un stimul aversiv cu un stimul preferat pare neobișnuită, dar nu este neobișnuită (pentru o recenzie, vezi Insel și Young 2001). De exemplu, oile și șobolanii prezintă aversiuni față de descendenții lor, care este suprascrisă pentru exprimarea comportamentului matern (Fleming și colab. 1999; Keller și colab. 2005).

Rezumat și implicații

Aceste date, alături de cercetările anterioare, sugerează că integrarea funcțională sau disocierea zonelor creierului într-un circuit neuronal de învățare poate sta la baza schimbărilor maturale în învățare. Aceste date ilustrează faptul că sugarul nu este o versiune imatură a adultului, ci a fost modelat prin presiuni evolutive pentru a fi adaptat în mod unic pentru stadiul său particular de dezvoltare (Rovee-Collier 1997; Hofer și Sullivan 2001).

Materiale și metode

Subiecte

Am folosit pui de sex masculin și femele născuți de șobolani Long-Evans (Harlan) în vivariul nostru de animale. Vârstele puilor au fost PN7 - PN8 (puii sunt în mare parte închiși la cuib), PN12 - PN13 (puii se aventurează în afara cuibului, dar necesită în continuare mama pentru supraviețuire) și PN23 - PN24 (înțărcători, puii locuiau încă cu mama ). Mamele au fost adăpostite în cuști din polipropilenă cu o cantitate abundentă de așchii de lemn de aspen pentru construirea cuiburilor și ținute într-un mediu de 20 ° C cu un ciclu de 12 ore de lumină/12 ore de întuneric. Hrana și apa erau disponibile ad libitum. Litere au fost sacrificate la 10-12 bărbați și femele pe PN1 sau PN2, cu PN0 desemnată ca zi de naștere. Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Oklahoma, care urmează liniile directoare de la Institutul Național de Sănătate, a aprobat toate procedurile experimentale și de îngrijire a animalelor.

Condiționare LiCl

Antrenamentul a avut loc în mediul de 27 ° C (înțărcare) până la 30 ° C (sugari) ± 0,1 ° C, cu temperatură la începutul antrenamentului menținută pe tot parcursul condiționării. Puii au fost plasați în camera de antrenament și li s-au administrat 10 minute pentru a se recupera de la manipularea experimentală. Starea de rău a fost confirmată prin observarea puilor pentru numărul defecației, consistența și culoarea în timpul și după condiționarea (1 oră). Puii au fost readuși în cuib până la testarea a doua zi.

Camerele de antrenament erau (45,5 l × 30,5 l × 45 h cm) cutii opace de plexiglas. Puii au fost repartizați aleatoriu în una dintre următoarele condiții: (1) Împerecheați fără mamă și (2) Împerecheați cu mama. Ambele grupuri asociate au primit LiCl (0,3 M) de 1% din greutatea corporală injectat la 5 minute după începerea prezentării mirosului de 30 de minute. (3) Numai LiCl: injectat cu LiCl 5 minute după ce a fost plasat în cutia de antrenament. (4) Numai miros: expus la miros și injectat cu soluție salină izotonică (1% greutate corporală) la 5 minute după începerea mirosului. Mirosul de 30 de minute a fost prezentat pe o șervețelă Kim (25 μL de mentă de menta McCormick pură cu alcool îndepărtat chiar înainte de utilizare) și plasat sub podeaua din plasă metalică. Un nou miros pe care Kim șterge a fost înlocuit la jumătatea condiționării. Puii au fost injectați cu LiCl la 5 minute după începerea mirosului. Mama (nonbiologică) prezentă în timpul condiționării a fost anesteziată (1,5-3 mL uretan; 0,25 g/mL ip), ceea ce previne, de asemenea, ejecțiile de lapte. Mama a fost plasată în cutia de antrenament de pe partea ei pentru a oferi puii acces la sfarcurile ei pentru alăptare. Pentru a asigura atașarea mamelonului, puii din toate condițiile de antrenament (inclusiv cei care nu se aflau în condiția de formare medicală) au fost separați de mamă timp de 2-4 ore înainte de experiment. Toți puii care alăptează mirosul LiCl au alăptat în timpul condiționării.

2-DG autoradiografie

Jumătate din puști în fiecare condiție de antrenament au fost folosiți pentru a evalua circuitele neuronale asociate învățării. Puii au fost injectați cu 14C 2-dezoxiglucoză (2-DG; 20 μCi/100g, sc) cu 5 minute înainte de condiționare; La 45 de minute după injecție, puii au fost decapitați și creierul lor îndepărtat rapid, înghețat în 2-metilbutan (-45 ° C) și depozitat într-un congelator de -70 ° C. Pentru analiză, creierele au fost secționate (20 μm) într-un criostat de -20 ° C, cu fiecare a doua secțiune plasată pe o lamă de acoperire și expusă timp de 5 zile împreună cu standardele (standardele Carbon 14 10 × 0,02 mCi, American Radiolabeled Chemicals, Inc.) la filmul cu raze X (DiRocco și Hall 1981; Coopersmith și Leon 1986; Sullivan și Wilson 1995). Bulbul olfactiv nu necesită colorare, deoarece reperele anatomice sunt clar vizibile cu 2-DG, cu absorbție 2-DG în zona specifică de mentă a stratului glomerular exprimată în raport cu miezul periventricular al bulbului (Greer și colab. 1981). Nucleii amigdali specifici au fost identificați prin contracolorarea secțiunilor cu violet crezil și prin realizarea unui șablon al zonei creierului respectiv pentru utilizare cu autoradiografiile. Absorbția 2-DG a fost exprimată în raport cu absorbția 2-DG în corpul calos (care nu a variat în funcție de grupul de condiționare) pentru a controla diferențele în grosimea secțiunii și expunerea (Sullivan și colab. 2000). Zonele cerebrale examinate au fost nucleii amigdaloizi bazolaterali, laterali, corticali, mediali și centrali.

Testarea labirintului Y pentru aversiunea și preferința mirosului

Testarea labirintului Y a fost efectuată în ziua următoare antrenamentului pentru a evalua învățarea mirosurilor, fiecare braț conținând mirosul condiționat vs. brici familiare cuiburi curate. Labirintul Y consta dintr-o cutie de pornire (7 × 9 cm) separată de uși detașabile de cele două alei (22 × 9 cm) care se extindeau la unghiuri de 45 °. Un braț conținea mirosul de lemn de aspen folosit în cuib ca așternut (20 ml de bărbierit curat, aspen într-o cutie Petri), în timp ce celălalt braț conținea mirosul de mentă (25 μL de extract de mentă pe un kimwipe plasat într-o hotă de ventilație pentru 5 minute). Fiecare pui a fost plasat în cutia de start și dat 5 secunde înainte ca ușile aleii să fie îndepărtate. Fiecare subiect a avut 60 de secunde pentru a face o alegere, ceea ce a impus puilor să intre pe una dintre alei. Toți puii testați au făcut o alegere în 60 de secunde. Fiecare subiect a primit cinci încercări secvențiale, iar podeaua a fost curățată între fiecare proces. Orientarea puilor a fost contrabalansată între încercări. Observațiile fiecărui pui au fost făcute orb de condiția de antrenament.