Erfan Eilati

1 Departamentul de Fiziologie, Universitatea Southern Illinois - Carbondale, Școala de Medicină, Carbondale, IL, 62901, SUA

Janice M. Bahr

2 Departamentul de Științe Animale, Universitatea din Illinois la Urbana-Champaign, 1207 W. Gregory Dr., Urbana, IL, 61801, SUA

Dale Buchanan Hales

1 Departamentul de Fiziologie, Universitatea Southern Illinois - Carbondale, Școala de Medicină, Carbondale, IL, 62901, SUA

Abstract

Obiectiv

Cancerul ovarian este cea mai letală malignitate ginecologică. Prevenirea poate fi cea mai bună abordare pentru reducerea cancerului ovarian. Semințele de in sunt cea mai bogată sursă vegetală de acizi grași omega-3, care poate fi eficientă în prevenirea cancerului ovarian. Prostaglandina E2 (PGE2) este cel mai proinflamator ecoisanoid și unul dintre produsele din aval a două izoforme ale enzimelor ciclooxigenazei (COX): COX-1 și COX-2. Obiectivul nostru a fost de a determina dacă consumul pe termen lung al unei diete îmbogățite cu semințe de in a scăzut severitatea și incidența cancerului ovarian la găina ouătoare și a investiga corelația sa potențială cu expresia enzimelor COX și a concentrației PGE2.

Metode

Găinile albe Livorno au fost hrănite cu o dietă standard de 10% îmbogățită cu semințe de in sau timp de 4 ani. Severitatea și incidența cancerului ovarian au fost determinate de patologia și histologia brute. Expresia proteinei COX-1 și COX-2 și ARNm și concentrațiile de PGE2 în ovare au fost măsurate prin Western blot, PCR cantitativă în timp real și respectiv ELISA.

Rezultate

Rezultatele au demonstrat că a existat o reducere a severității cancerului ovarian și a incidenței la găinile hrănite cu dieta din semințe de in. În corelație cu severitatea și incidența cancerului ovarian scăzut, concentrația PGE2 și expresia COX-2 au fost diminuate în ovarele găinilor hrănite cu semințe de in.

Concluzii

Descoperirile noastre sugerează că nivelurile mai scăzute de COX-2 și PGE2 sunt principalii factori care contribuie la rolul chimiorepresiv al consumului pe termen lung de semințe de in în cancerul ovarian la găinile ouătoare. Aceste descoperiri pot oferi baza studiilor clinice de intervenție dietetică care vizează biosinteza prostaglandinelor pentru prevenirea și tratamentul cancerului ovarian.

Introducere

Prevenirea cancerului ovarian este cea mai bună abordare pentru reducerea impactului acestei boli mortale. Progresele în tratamentul și prevenirea cancerului ovarian au fost împiedicate din cauza lipsei unui model animal valid și adecvat și a absenței unor strategii eficiente de chimioprevenție. Descoperirile promițătoare provin din studii efectuate cu găina ouătoare, un model robust al cancerului ovarian spontan care recapitulează boala umană. Intervenția dietetică cu semințe de in, cea mai bogată sursă vegetală de acizi grași omega-3 (OM-3FAs) și fitoestrogeni lignani, demonstrează potențialul de prevenire și ameliorare eficientă a cancerului ovarian prin vizarea căilor inflamatorii de prostaglandine.

Ciclooxigenaza (COX) este enzima care limitează viteza în catalizarea conversiei acidului arahidonic (AA) în prostaglandină H2. Sintazele specifice de prostaglandine acționează asupra PGH2 pentru a produce prostaglandine și tromboxani. Două izoforme identificate ale ciclooxigenazei sunt: ​​COX-1 și COX-2 care au structură și funcție similară, dar codificate cu gene diferite (PTGS1 și PTGS2) și prezintă modele de expresie distincte. Ambele enzime COX pot fi implicate în stabilirea tumorii [1] și menținerea tumorilor existente [2]. Reglarea în sus a COX-2 a fost raportată în multe cazuri maligne, cu toate acestea, noi și alții am arătat că COX-1 este supra-exprimat în cancerul ovarian [2-4]. Prostaglandinele (PG) sunt produse în aval de enzime ciclooxigenază și PGE2 este frecvent crescută în diferite tipuri de cancer uman, inclusiv cancerele de colon, plămâni, sân și cap și gât [5].

Intervenția dietetică cu semințe de in pentru prevenirea cancerului a fost propusă pentru prima dată de Budwig în anii 1950 [6]. Consumul OM-3FA a fost asociat cu prevenirea multor tipuri de cancer. Au fost raportate efecte inhibitorii semințelor de in asupra prostatei [7], intestinului și cancerului de colon [8]. Mecanismul cel mai bine înțeles pentru acțiunea chimio-preventivă a OM-3FA este efectul lor de supresie asupra producției de prostanoizi derivați de acid arahidonic, în special PGE2 [9]. Semințele de in sunt cele mai bogate surse vegetale de acid alfa-linolenic OM-3FA (ALA, C18: 3 ω-3). ALA este alungită pentru a forma acid eicosapentaenoic (EPA, C20: 5 ω-3) și docosahexaenoic (DHA, C20: 6 ω-3) acid în intestin. Împreună cu OM-3FA, lignanul de semințe de in secoisolariciresinol diglucozid (SDG) este metabolizat în tractul digestiv în fitoestrogeni enterodiol (END) și enterolactonă (ENL), care sunt anti-estrogeni puternici. În plus față de acțiunile potențiale anticancerigene ale semințelor de in prin antagonism estrogen, metaboliții lignanului sunt, de asemenea, antioxidanți puternici cu capacitatea de a inhiba peroxidarea lipidelor și scindarea ADN-ului și de a elimina radicalii hidroxilici [10].

Cancerul ovarian este a cincea cauză principală de deces prin cancer în rândul femeilor și rămâne cea mai letală malignitate ginecologică. Indiferent de originea cancerului ovarian, există dovezi care sugerează că femeile cu un număr mai mic de ovulații în timpul vieții reproductive sunt mai puțin predispuse să dezvolte cancer ovarian. Deși rolul pe care l-ar putea juca ovulația este controversat, este evident că ovulația este importantă pentru inițierea bolii [11]. Multiparitatea, durata lactației și utilizarea pilulelor contraceptive reduc toate riscurile de cancer ovarian epitelial [12]. Găinile domestice ovulează aproape zilnic și dezvoltă spontan adenocarcinoame ovariene care sunt similare în aspect histologic cu carcinoamele ovariene umane și care au simptome similare ale bolii, cum ar fi lichidul de ascită perfuzată și diseminarea metastatică peritoneală [13, 14].

Am raportat că găinile ouătoare vechi care au fost hrănite cu o dietă îmbogățită cu semințe de in timp de un an au cunoscut o scădere semnificativă a severității cancerului ovarian și o creștere a supraviețuirii. Eficacitatea pe termen lung a intervenției dietetice cu semințe de in asupra incidenței cancerului ovarian și mecanismele prin care funcționează semințele de in este neclară. Scopurile acestui studiu au fost 1) de a determina dacă consumul pe termen lung (> 4 ani) a unei diete îmbogățite cu semințe de in scade atât incidența cancerului ovarian, cât și severitatea; și 2) pentru a investiga corelația dintre expresia enzimei ovariene COX, concentrațiile țesuturilor PGE2, consumul de semințe de in și incidența cancerului la găinile ouătoare vechi. Rezultatele acestui studiu demonstrează că consumul pe termen lung de semințe de in scade incidența și severitatea cancerului ovarian la găini. Mai mult, expresia COX-2, dar nu și COX-1 și nivelurile de PGE2 în ovare au fost semnificativ reduse prin consumul de semințe de in. Rezultatele sugerează că semințele de in vizează calea prostaglandinelor pentru a preveni și trata această malignitate extrem de letală.

Material si metode

Animale

1200 de pui cu un singur pieptene de culoare albă, cu vârsta de 6 luni, au fost împărțiți aleatoriu în două grupuri (n = 600). Primul grup a fost alimentat cu dietă de control și al doilea grup a fost alimentat cu 10% dietă îmbogățită cu semințe de in. Compoziția dietelor a fost prezentată anterior [15]. Un procent atât de porumb, cât și de soia au fost îndepărtați din dieta experimentală pentru a menține dietele izocalorice cu adăugarea semințelor de in. Găinile au fost hrănite cu 110 grame de furaje pe zi și au primit apă ad libitum. Găinile din dieta cu semințe de in au consumat aproximativ 11 grame de semințe de in pe zi, sau 6,2g/kg greutate corporală. Găinile au fost menținute trei pe cușcă și expuse la o fotoperioadă de 17 h lumină: 7 h întuneric, cu lumini aprinse la 05:00 h și lumini stinse la 22:00 h. Gestionarea animalelor și procedurile au fost revizuite și aprobate de comitetele instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Illinois din Urbana-Champaign, Universitatea Illinois din Chicago și Universitatea Southern Illinois din Carbondale.

Colectarea țesutului

La vârsta de 12, 19, 24, 31, 36 și 45 de luni, douăzeci de găini din fiecare grup de control și semințe de in au fost selectate aleatoriu, eutanasiate folosind asfixare cu CO2 și necropsiate. Probele de la puii cu vârsta cuprinsă între 19, 31 și 45 de luni au fost desemnați ca fiind de 1,5, 2,5 și respectiv 3,5 ani. Țesuturile ovariene au fost prelucrate așa cum s-a descris anterior [16].

Histologie

Țesuturile ovariene fixate în NBF au fost prelucrate și parafina încorporată așa cum s-a descris anterior [3, 14, 17]. Patru secțiuni micrometrice au fost tăiate și montate pe lamele de microscop SuperFrost Plus. Lamelele au fost deparafinizate și rehidratate prin xilen și soluții de etanol gradate. Colorarea hematoxilinei și a eozinei a fost efectuată așa cum este descris [18].

Extracția și analiza ARN și PCR cantitativă în timp real

ARN-ul total a fost extras din țesutul ovarian folosind reactivul Trizol. Cuantificarea și verificarea calității au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [16]. Probele de ARN au fost tratate cu DNaza fără RN1 RNază înainte de reacția de transcripție inversă. ADNc a fost sintetizat din ARN tratat cu DNază cu trusa de arhivă de ADNc de mare capacitate. Primerii specifici puiului și standardele plasmidice utilizate pentru fiecare genă au fost proiectate și qRT-PCR a fost efectuată așa cum s-a arătat anterior [16].

Western blot

Proteinele au fost extrase din probe de țesut ovarian înghețat și Western blot a fost efectuată pentru a detecta COX-1 și COX-2 așa cum s-a descris anterior [16].

PGE2 EIA

Cantitatea de PGE2 din țesuturile ovariene de la găini, atât în ​​grupul martor, cât și în grupurile hrănite cu semințe de in, a fost măsurată utilizând o imunoanaliză enzimatică specifică, așa cum s-a arătat anterior [16].

analize statistice

Toate experimentele au fost efectuate în duplicat la fiecare moment (n = 20) și diferențele în datele din grupuri au fost analizate cu GraphPad InStat utilizând ANOVA unidirecțional cu Student - Newman - Keuls. Datele dicotomice au fost analizate folosind testul Chi Square din GraphPad InStat. Diferențe de rezultat cu o valoare A de P Fig. 1A - F). Tumorile provenite atât din dieta de control, cât și din grupurile de dietă îmbogățită cu semințe de in au fost analizate și caracterizate în conformitate cu o metodă de clasificare tumorală publicată anterior [15]. Figura 1G prezintă procentul de găini cu cancer ovarian. Nu a fost detectată nicio afecțiune malignă la ovarele găinilor hrănite cu o dietă îmbogățită cu semințe de in și la găinile hrănite cu dietă martor cu vârsta de 1, 1,5 și 2 ani; cu toate acestea, 6 luni mai târziu, 10% dintre puii de 2,5 ani hrăniți cu dietă de control (n = 2) au avut cancer ovarian, în timp ce 5% dintre găinile hrănite cu o dietă de semințe de in au avut cancer ovarian (n = 1). Șaizeci și cinci la sută din găinile de 3 ani hrănite cu dietă de control (n = 13) au avut cancer ovarian, dar dieta îmbogățită cu semințe de in a redus prevalența cancerului ovarian la 45% la găinile de aceeași vârstă (n = 9), însă diferența nu a fost semnificativă statistic (P> 0,05). Doar 20% din vârstele de 3,5 ani au hrănit cu o dietă îmbogățită cu semințe de in (n = 4) au avut cancer ovarian, în timp ce cincizeci la sută din găinile de 3,5 ani hrănite cu dietă de control (n = 10) au avut cancer ovarian, indicând faptul că semințele de in au redus semnificativ incidența cancerului ovarian în Găini de 3,5 ani (P Fig. 1H). În schimb, găinile din dieta de control au prezentat mai multe tumori în stadiu târziu (T3/T4) care au prezentat lichid de ascită și metastaze comparativ cu grupul de semințe de in.

dietă

(A) Anatomia grosieră a ovarului normal cu o ierarhie a foliculilor în curs de dezvoltare; (B) ovar clasificat ca suspect; (C) ovar prelevat de la o găină cu cancer ovarian în stadiu târziu metastatic; (D) pata H&E a ovarului normal cu foliculi mici în curs de dezvoltare; (E) Pata H&E a ovarului suspectat a arătat o stomă disociată cu un număr neobișnuit de mare de vase de sânge și a fost evidentă formarea de leziuni focale în stroma de sub suprafața ovariană (săgeată); (F) Colorația H&E a cancerului ovarian în stadiu târziu metastatic cu zone solide compuse din foi asemănătoare fantei care conțin celule cu atipii nucleari de înaltă calitate și câteva glande mici au fost, de asemenea, observate fără papile. Bara de calibrare, 20µm (G) Procentul incidenței cancerului ovarian la găinile hrănite cu dietă îmbogățită cu semințe de in și control. Necropsia găinilor a fost efectuată în diferite momente de timp (n = 20), iar ovarele au fost clasificate ca fiind normale, canceroase sau discutabile. Țesuturile ovariene discutabile au fost analizate prin histologie pentru a confirma țesutul ovarian canceros. Nu s-a detectat malignitate ovariană la femelele de 1 (n = 0/20), 1,5 (n = 0/20) și 2 (n = 0/20) ani, atât în ​​grupul de semințe de in, cât și în grupul martor; cu toate acestea, 10% din găinile hrănite cu dietă martor de 2,5 ani (n = 2/20) au avut cancer ovarian, în timp ce 5% (n = 1/20) dintre găinile hrănite cu semințe de in au avut cancer ovarian. A existat o diferență în incidența cancerului ovarian la găinile în vârstă de 3 ani hrănite cu dietă de control (n = 13/20) (65%) comparativ cu găinile hrănite cu o dietă îmbogățită cu semințe de in cu vârsta la fel (n = 9/20) (45%), dar nu a fost semnificativă statistic. Dieta îmbogățită cu semințe de in a redus semnificativ incidența cancerului ovarian la găinile în vârstă de 3,5 ani comparativ cu găinile hrănite cu dieta de control (P 0,05; Fig. 2). Nu a existat nicio diferență în expresia proteinei COX-1 și ARNm între ovarele canceroase ale găinilor hrănite cu o dietă îmbogățită cu semințe de in și găinile ovare canceroase hrănite cu dieta de control la fiecare moment (P> 0,05; Fig. 3).

Exprimarea proteinei COX-1 și a ARNm a fost măsurată în ovarele normale ale găinilor hrănite cu semințe de in îmbogățite și ovarele normale ale găinilor hrănite cu dietă martor la intervale de aproximativ 6 luni. (A&B) Nu au fost observate diferențe semnificative în expresia proteinei COX-1 la ovarele normale ale găinilor hrănite fie cu dietă îmbogățită cu semințe de in, fie cu dietă de control la toate vârstele (P> 0,05). (C) Similar cu expresia proteinei, dieta din semințe de in nu a modificat expresia mARN-ului COX-1 în ovarele normale ale găinilor, comparativ cu ovarele găinilor hrănite cu dieta de control (P> 0,05). Barele indică o eroare standard.

Exprimarea proteinei COX-1 și a ARNm a fost măsurată în ovarele canceroase ale găinilor hrănite cu o dietă îmbogățită cu semințe de in și în ovarele canceroase ale găinilor hrănite cu dietă martor la intervale de aproximativ 6 luni. Nu a existat nicio diferență semnificativă în expresia proteinei COX-1 (A&B) și ARNm (C) la ovarele canceroase ale găinilor în vârstă de 3 și 3,5 ani hrănite cu o dietă îmbogățită cu semințe de in comparativ cu găinile potrivite cu vârsta hrănite cu dieta de control (P> 0,05). Barele indică o eroare standard.

Efectul semințelor de in asupra expresiei COX-2

Discuţie

Noi și alții am arătat că COX-1 este supra-exprimat în cancerul ovarian [2-4]. A fost prezentată anterior reglarea sintezei PGE2 de către COX-1 în liniile celulare de cancer ovarian [22] și ovarele de găină cu tumoră [4]. Aceste descoperiri indică faptul că vizarea activității COX-1 poate fi un mecanism de acțiune a semințelor de in pentru atenuarea și chiar suprimarea cancerului ovarian. Nu s-au găsit modificări ale expresiei COX-1 și ale expresiei ARNm în ovarele normale sau canceroase ale găinilor ouătoare în dieta de semințe de in comparativ cu găinile din dieta de control, indicând faptul că semințele de in nu afectează expresia enzimei COX-1 în ovarele de găină. Cu toate acestea, este probabil ca acizii grași omega-3 din semințe de in să scadă activitatea enzimei COX-1 prin modularea nivelurilor de substrat, așa cum este descris mai jos, rezultând o scădere a PGE2.

Mulți ani de ovulație, expunerea mai îndelungată la factorii de mediu, îmbătrânirea ovariană și deteriorarea ADN-ului acumulat ar putea fi asociate cu o rată crescută de cancer ovarian cu vârsta. Am arătat o creștere a incidenței cancerului ovarian la găina ouătoare după doi ani de ovulație, concomitent cu niveluri crescute de PGE2 [16]. Mai mult, am arătat că, deși COX-1 crește odată cu cancerul, COX-2 crește odată cu vârsta [3]. Propunem că creșterea PGE2 legată de vârstă poate contribui la stabilirea unui mediu procarcinogen care ajută la promovarea carcinogenezei ovariene.

COX-2 inițiază procesul inflamator [37] și este legat de formarea și promovarea tumorilor și inhibarea apoptozei, angiogeneza și procesul metastatic [38]. Consumul de diete îmbogățite cu OM3-FA a avut efecte inhibitoare asupra producției de COX-2 și de prostaglandine atât în ​​tumorile plasmatice, cât și în cele induse experimental [39], dar efectul semințelor de in, ca sursă vegetală de OM-3FAs asupra expresiei COX-2 în cancerul ovarian este necunoscut. Datele noastre au indicat faptul că dieta îmbogățită cu semințe de in scade expresia COX-2 în ovarele normale ale găinilor cu vârsta cuprinsă între 2,5, 3 și 3,5 ani, comparativ cu găinile hrănite cu vârsta potrivită cu dieta de control. Mai mult, dieta din semințe de in a scăzut expresia COX-2 la ovarele canceroase ale găinilor cu vârsta de 3 și 3,5 ani comparativ cu ovarul canceros

de găini potrivite vârstei hrănite cu dietă de control. Rezultatele noastre sunt în acord cu rapoartele anterioare care au arătat că semințele de in dietetice reduc expresia COX-2 în cancerul de colon la șobolani [40], iar ALA dietetică reduce expresia COX-2 și induce apoptoza în celulele hepatomului [41]. Prezentul studiu confirmă rapoartele anterioare și demonstrează că COX-2 crește în funcție de vârstă, nu cancerul ovarian în sine.