Departamentul de afiliere pentru medicină internă al Facultății de Medicină a Universității din São Paulo, São Paulo, Brazilia

scăzut

Departamentul de afiliere pentru medicină internă al Facultății de Medicină a Universității din São Paulo, São Paulo, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru medicină internă al Facultății de Medicină a Universității din São Paulo, São Paulo, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru medicină internă al Facultății de Medicină a Universității din São Paulo, São Paulo, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru medicină internă al Facultății de Medicină a Universității din São Paulo, São Paulo, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru medicină internă al Facultății de Medicină a Universității din São Paulo, São Paulo, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru medicină internă al Facultății de Medicină a Universității din São Paulo, São Paulo, Brazilia

  • Priscila Seravalli,
  • Ivone Braga de Oliveira,
  • Breno Calazans Zago,
  • Isac de Castro,
  • Mariana Matera Veras,
  • Edson Nogueira Alves-Rodrigues,
  • Joel C. Heimann

Cifre

Abstract

Introducere

Studiile anterioare din laboratorul nostru au demonstrat că supraîncărcarea sării din dietă și restricția de sare în timpul sarcinii au fost asociate cu modificări structurale și/sau funcționale cardiace și renale la descendenții adulți. Prezentul studiu a evaluat structura renală și cardiacă și sistemul local renină-angiotensină la nou-născuți de la baraje hrănite cu diete bogate, normale sau cu conținut scăzut de sare în timpul sarcinii.

Metode

Șobolanii femele Wistar au fost hrăniți cu diete cu sare scăzută (LS, 0,15% NaCI), normală (NS, 1,3% NaCI) sau mare (HS, 8% NaCI) în timpul sarcinii. Rinichii și inimile au fost colectate de la nou-născuți (n = 6-8/grup) în primele 24 de ore după naștere pentru a evalua posibilele modificări ale structurii folosind stereologia. Expresia proteinelor a componentelor sistemului renină-angiotensină a fost evaluată folosind o analiză indirectă imunosorbentă legată de enzime (ELISA).

Rezultate

Nu s-au observat diferențe între grupuri în volumul total renal, volumul compartimentelor renale sau numărul de glomeruli. Diametrul transvers al nucleilor cardiomiocitelor a fost mai mare la HS decât la bărbații NS din ventriculii stâng și drept. Expresia proteinelor a receptorului AT1 a fost mai scăzută la rinichii LS decât la cei din NS și HS masculi, dar nu și femele. Expresia proteinelor a receptorului AT2 a fost mai mică la rinichii bărbaților și femelelor LS decât la cei la bărbații și femelele NS.

Concluzie

Consumul ridicat de sare în timpul sarcinii a indus hipertrofia ventriculară stângă și dreaptă la nou-născuții masculi. Restricția sării în timpul sarcinii a redus expresia receptorilor renali de angiotensină II la nou-născuți.

Citare: Seravalli P, de Oliveira IB, Zago BC, de Castro I, Veras MM, Alves-Rodrigues EN, și colab. (2016) Aport mare și redus de sare în timpul sarcinii: impact asupra structurii cardiace și renale la nou-născuți. PLoS ONE 11 (8): e0161598. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0161598

Editor: Jaap A. Joles, Centrul Medical Universitar Utrecht, OLANDA

Primit: 18 ianuarie 2016; Admis: 8 august 2016; Publicat: 25 august 2016

Disponibilitatea datelor: Toate fișierele GraphPad Prism (analize statistice) sunt disponibile din baza de date Figshare (numărul de acces DOI 10.6084/m9.figshare.3465413).

Finanțarea: Acest studiu a fost finanțat de FAPESP - Fundația Amparo din Pesquisa do Estado de São Paulo (Fundația de cercetare de stat din São Paulo) - Numărul de subvenție 2013/00458-7 și de CAPES - Coordination of Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Un studiu anterior din laboratorul nostru a demonstrat că șobolanii Wistar masculi adulți hrăniți cu o dietă bogată în sare și născuți din baraje expuse la supraîncărcare de sare în timpul sarcinii au dezvoltat hipertrofie ventriculară stângă comparativ cu descendenții masculi adulți născuți din baraje hrănite cu o dietă cu sare normală în timpul sarcinii [1 ]. Dieta maternă bogată în sare în timpul sarcinii poate provoca disfuncții cardiace la descendenții șobolanilor hipertensivi spontan [2]. Aportul excesiv de sare în timpul sarcinii și alăptării este, de asemenea, asociat cu proteinurie și o rată scăzută de filtrare glomerulară la șobolanii Wistar în vârstă de nouăzeci de zile [3]. Koleganova și colab. au constatat că descendenții adulți ai barajelor hrăniți cu diete bogate în sare și descendenții barajelor hrăniți cu diete sărace în timpul sarcinii și alăptării prezintă un număr mai mic de nefroni decât descendenții din barajele alimentate cu o dietă cu sare normală în perioada perinatală [4]. Hrănirea unei diete cu conținut scăzut de sare în perioada perinatală este asociată cu greutate redusă la naștere și rezistență la insulină în timpul maturității [5].

Puține studii au investigat efectul gradului de aport de sare maternă în timpul gestației și/sau alăptării asupra modificărilor structurale și funcționale la nou-născuți. Nu se cunoaște dacă efectele descrise ale supraîncărcării sau restricției de sare în perioada perinatală la descendenții adulți sunt deja prezente la nou-născuți. Prin urmare, acest studiu a investigat efectele aportului scăzut sau ridicat de sare în timpul sarcinii la șobolanii Wistar asupra structurilor cardiace și renale și a expresiei proteinelor componentelor sistemului local renină-angiotensină (RAS) la descendenții nou-născuți.

Metode

Comitetul pentru evaluarea proiectelor de cercetare a Facultății de Medicină a Universității din São Paulo, Brazilia, a aprobat anterior toate experimentele (numărul de certificat 044/14).

Animale

Grupuri materne.

Șobolani femele Wistar în vârstă de opt săptămâni au fost furnizate de unitatea instituțională pentru animale din cadrul Școlii de Medicină a Universității din São Paulo. Animalele au fost adăpostite într-o cameră cu temperatură controlată de la 21 la 22 ° C și un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore și li s-a oferit acces gratuit la alimente (NS - 1,3% clorură de sodiu - Nuvilab CR1-Colombo, PR, Brazilia) și apă . La vârsta de 12 săptămâni, femelele au fost împerecheate cu șobolani Wistar masculi care au fost hrăniți cu NS. Identificarea pozitivă a spermatozoizilor în frotiurile vaginale a marcat prima zi a sarcinii. Șobolanii au fost împărțiți în acest moment în trei grupuri în funcție de o dietă atribuită (Harlan Teklad, Madison, WI, SUA) până la sfârșitul sarcinii: scăzută (LS, 0,15%), normală (NS, 1,3%) sau ridicată - Dieta cu sare (HS, 8% NaCI) conform protocolului descris de Rodrigues și colab. (2013). Greutatea corporală și consumul de alimente au fost evaluate săptămânal în timpul sarcinii.

Grupuri de descendenți.

Nou-născuții au fost cântăriți, separați după sex și eutanasiați prin decapitare în primele 24 de ore după naștere. Au fost evaluați patru până la opt descendenți din șapte sau opt baraje. Rinichii și inimile au fost colectate imediat și cântărite. Jumătate din aceste organe au fost înghețate în azot lichid și depozitate la -80 ° C pentru analize moleculare. Cealaltă jumătate a fost fixată prin imersie în paraformaldehidă 4% (PBS, pH 7,4) timp de 24 de ore și transferată la 70% etanol până la analize în studiile stereologice.

Analiza stereologică.

Rinichii și inimile au fost procesate în mod obișnuit pentru încorporarea parafinei. Am încorporat întregul rinichi și am produs secțiuni paralele cu axa sa principală. Întreaga inimă era de asemenea încorporată, dar axa sa majoră era perpendiculară pe planul secțiunii. Blocurile care conțin rinichi și inimi au fost secționate exhaustiv la 5 μm folosind un microtom. Fiecare a 60-a (rinichi) și a 70-a felie (inimă) a fost colectată pe o lamă de sticlă până la sfârșitul ambelor blocuri. De asemenea, am colectat intervale aleatorii de 10 perechi de secțiuni renale (D = 15 μm) pentru a estima numărul de glomeruli. Am folosit o schemă de eșantionare sistematică, uniformă, aleatorie pentru a selecta secțiuni pentru analiză [6]. Hematoxilina și eozina au fost utilizate pentru colorarea secțiunilor.

Volumele totale de rinichi și inimă.

Am obținut volumul total al inimilor și rinichilor folosind principiul Cavalieri [6].

Fracțiuni de volum și volume totale de compartimente renale și cardiace.

Am folosit metoda numărării punctelor pentru a estima fracția de volum (comp Vv) a fiecărui compartiment major al rinichiului (cortex, medulă și pelvis) și a inimii (sept, ventricul stâng, ventricul drept și cavitățile respective) [7]. Am folosit aceleași microfotografii cu mărire redusă (2,5 ×) care au fost pregătite pentru a estima volumul de organ și același sistem de puncte de testare suprapus cu ajutorul software-ului ImageJ [http://rsb.info.nih.gov/ij/] [8 ]. Am efectuat numărări diferențiale de puncte care cad pe structurile de interes și am folosit următoarea formulă: (1) am estimat comp Vv și am multiplicat comp Vv cu volumul total (2) al organului (rinichi sau inimă) pentru a obține totalul volumul (V comp) al compartimentului. (1) (2) unde ∑pt (comp) este suma punctelor care se încadrează într-un compartiment definit în seria de secțiuni analizate și ∑pt (struct) este suma punctelor care se încadrează în celelalte structuri (compartimente) ale organ.

Numărul total de Glomeruli.

Am determinat numărul glomerular folosind metoda disectorului fizic [9]. Aceleași câmpuri vizuale pe o pereche de secțiuni au fost fotografiate și tipărite. Am folosit un cadru de numărare imparțial tipărit pe acetat pentru aceste numărări. Aceste cadre au fost suprapuse în ambele secțiuni și s-au numărat glomeruli care au fost eșantionați de cadru în prima secțiune, dar care nu erau prezenți în al doilea cadru. Numărul a fost, de asemenea, efectuat prin compararea celei de-a doua secțiuni a perechii cu prima secțiune pentru a dubla precizia. Am analizat șase disectoare în fiecare pereche de secțiuni în zece perechi de secțiuni. Următoarele formule (3) (4) au fost utilizate pentru a obține densitatea numerică (Nv) și numărul total (N) de glomeruli. (3) unde ΣnG este numărul total de glomeruli contorizați în toate disectoarele, VDIS este volumul disectorului (aria cadrului x distanța dintre perechea de secțiune), iar Σpf este suma cadrelor cu punctele asociate care lovesc cortexul.

Diametrul transvers al nucleului cardiomiocitelor.

Datorită imaturității cardiomiocitelor și dificultății de a defini clar marginile celulare pentru a evalua diametrul transversal, am estimat diametrul nucleului, care este un indicator util al hipertrofiei celulare [10]. Câmpurile vizuale aleatorii au fost selectate și fotografiate (40 ×) pentru aceste evaluări. Am prelevat nucleele pentru măsurare prin suprapunerea unui sistem de testare a punctelor. Când un punct a lovit un nucleu, acesta a fost selectat și s-au efectuat două măsuri perpendiculare, dintre care una se afla pe axa sa principală. Media acestor două măsuri a fost calculată și au fost măsurate cel puțin 100 de nuclee pentru fiecare inimă. ImageJ a fost utilizat pentru toate analizele.

ELISA.

Placa a fost spălată de trei ori timp de cinci minute cu agitare ușoară în PBS (200 μl per godeu) și incubată cu 100 μl de anticorp secundar, IgG anti-iepure, produs în capră și legat de fosfatază alcalină, SIGMA-ALDRICH, A3687, St. Louis, Missouri, SUA,) timp de două ore sub agitație ușoară. Au fost efectuate patru spălări folosind tampon PBS timp de cinci minute. După aceste spălări, s-au adăugat 100 μl de tampon de dezvoltare (100 mM Tris-base, Sigma 104 fosfatază substrat) și citit într-un cititor ELISA la o lungime de undă între 400 și 420 nm.

Au fost efectuate analize de varianță a unuia sau doi factori (ANOVA unidirecțional sau bidirecțional), după caz, urmate de teste ad-hoc Tukey, Bonferroni sau Fisher. Calculele au fost efectuate în software-ul GraphPad Prism ® versiunea 4.0 (GraphPad Software, Inc., California, SUA) sau IBM SPSS versiunea 19.0 (Armonk, New York, SUA). Nivelul de semnificație statistică a fost stabilit la p Tabelul 1. Efectul dietei scăzute, normale și bogate în sare în timpul sarcinii asupra mamelor și descendenților.

Volumele inimilor și compartimentelor descendenților

volumul cardiac total a fost mai mic în LS decât descendenții masculi NS. Nu au existat diferențe între volumele compartimentelor: ventriculul drept, cavitatea ventriculară dreaptă, septul interventricular, ventriculul stâng sau cavitatea ventriculară stângă. Volumul cardiac total nu a fost diferit între descendenții feminini din grupurile experimentale. Fracția de volum a cavității LV stânga a fost mai mică în grupul LS decât grupul HS, iar fracția de volum a septului interventricular a fost mai mare în grupul LS decât grupul HR (Tabelul 2).

Volumul renilor și compartimentelor descendenților și numărul glomerulilor

Volumul total al rinichilor și volumul compartimentului (cortex, medulă și pelvis) nu au fost diferite între cele trei grupuri experimentale la bărbații nou-născuți și la femele. Numărul de glomeruli nu a fost, de asemenea, diferit între grupurile experimentale, dar nou-născuții au prezentat un număr mai mare de glomeruli decât bărbații din cele trei grupuri experimentale (Tabelul 3).

Expresia proteinelor a receptorilor AT1 și AT2 în rinichi și inimă

Expresia proteinelor a receptorului AT1 în rinichi a fost mai mică (p> 0,05) la nou-născuții de sex masculin din grupul LS decât grupurile NS și HS. Expresia proteinelor receptorului AT1 la rinichii femelelor nu a diferit între grupurile experimentale. Cu toate acestea, expresia proteinelor receptorului AT1 în rinichi a fost mai mare (p Fig. 1. Expresia proteinelor în rinichi și inima descendenților nou-născuți.

(A) AT1 în rinichii mici; (B) AT2 în rinichii mici; (C) AT1 în inima masculină; (D) AT2 în inima masculină; (E) AT1 în rinichii feminini; (F) AT2 în rinichii feminini; (G) AT1 în inima femeii; (H) AT2 în inima feminină. n = 8 per grup. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SEM. * P # P Fig 2. Diametrul nuclear al cardiomiocitelor la descendenții neonatali.